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回答下列关于基因工程的相关问题。
质粒是基因工程中的一种常用的工具之一，经修饰改造后的质粒如下图七一1所示。PUC118上的Lacz基因编码β半乳糖苷酶的一条多肽链，其表达产物与菌落颜色有关；经“修饰”后的“多克隆位点”位于LacZ基因之中。AmpR是抗氮卞青霉素基因。
1．PUC118上的基因AmpR作用的是：________“多克隆位点”中含有多种限制酶的识别序列，如HindⅢ，其切割后产生的DNA片断中含有的部分序列是
，则限制酶HindⅢ的识别序列是________。
2．图2示意将目的基因导入大肠杆菌的操作步骤。其中，I～V表示操作过程；A－F表示使用的相关工其，其中的E1和E2表示有关的酶。试问：E2应是________（酶）；经过E2的切割，供体染色体中的DNA片段中游离的磷酸基团总数的变化是：________。
在策略上，图1中的“多克隆位点”包含了多种、多个识别序列，请说出设计这种“多克隆位点”的目的：________。
3．LacZ基因可以使细菌在含有X－gttl（5－溴－4－氯－3－吲哚－B－D－半乳糖）底物和IPTG（一种乳糖类似物）的培养基上形成蓝色的菌落，即X－gal被lacZ基因编码产生的鼻半乳糖昔酶水解成蓝色；若要形成重组质粒，则在含X－gal的培养基上将形成白色菌落（而不是蓝色的）。
请据图2分析下列问题：
①用本无PUC118的大肠杆菌作为受体细胞，将培养瓶C中被连接处理后的DNA混合物倾入含X－gal、IPTG和________的D培养基平板上，其目的是________。
菌落生长结果图2中所示。
②过程V进行转移培养，则该应该挑选X、Y、Z中的________菌落进行液体培养。形成该颜色的生理原因是________。如此目的基因便被克隆了！
(10分）研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂一内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题：
(1) 从肝细胞中分离总RNA，经_________获得cDNA，之后经过_________扩增内皮抑素基因。
(2) 扩增的目的基因与PUC18质粒（如图14所示）都用EcoRI和BamH I进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了________的连接，提高了重组质粒的比例。
(3) 大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入_______物质。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成______________颜色的菌落，原因是_____________________。之所以选择大肠杆菌作为基因工程的受体菌，其突出的优点是：___________________________________
(4) 从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，370C培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72h后在显微镜下观察细胞存活情况并，______________实验结果如下表所示。
结果说明__________________________________________
(10分）研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂一内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题：
(1) 从肝细胞中分离总RNA，经_________获得cDNA，之后经过_________扩增内皮抑素基因。
(2) 扩增的目的基因与PUC18质粒（如图14所示）都用EcoR I和BamH I进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了________的连接，提高了重组质粒的比例。
(3) 大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入_______物质。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成______________颜色的菌落，原因是_____________________。之所以选择大肠杆菌作为基因工程的受体菌，其突出的优点是：___________________________________
(4) 从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，370C培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72h后在显微镜下观察细胞存活情况并，______________实验结果如下表所示。
结果说明__________________________________________
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研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。
（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经________获得内皮抑素基因，再经________进行扩增，以获得更多的目的基因。
（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有________和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成________颜色的菌落，原因是__________________。
（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
| 粗提表达产物浓度/(μg·mL－1) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 活的内皮细胞数目(×102) | 12 | 6 | 2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
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