Question

【题目】对棉纤维基因GhRACK1的正常启动子P进行改造，获得了P1、P2、P3、P4缺失体。科研人员对正常启动子P及其4种缺失体（P1﹣P4）进行了实验研究。

（1）首先利用PCR技术扩增正常启动子P，方法如图1。

①不能直接根据片段Ⅰ扩增出正常启动子P，因为__。

②利用__酶处理使片段Ⅰ成为环状DNA。

③将环状DNA用__酶处理，得到片段Ⅱ．欲扩增出正常启动子P，需选用的引物组合为__。

（2）利用有关酶对正常启动子P进行切割，得到不同程度缺失体（P1﹣P4），图2表示正常启动子P缺失示意图。

（3）利用正常启动子P及其4种缺失体（P1﹣P4）分别构建了基因表达盒，如图3所示。

（4）再将5种基因表达盒分别转入相同质粒，构建相应的植物表达载体。然后将其导入农杆菌，最后导入烟草细胞中。用含有__的培养基对烟草细胞进行筛选，分别获得了含有正常启动子P及其4种缺失体（P1﹣P4）的转基因烟草。将植物组织浸入适量__溶液中，观察烟草细胞gus基因是否表达，实验结果如下表。

	根	叶	花粉
正常启动子P	幼根+根毛+	﹣	﹣
P1	+	+	+
P2	+	+	+
P3	+	+	+
P4	+	+	+

有蓝色：+ 无蓝色：﹣

如果烟草细胞gus基因成功表达，则细胞呈现蓝色．实验结果表明__。

与P1﹣P4的实验结果相比，说明正常启动子P发挥不同功能的关键序列位于图2的__。（填字母）

Answer 1

【答案】正常启动子P左侧序列未知 Bgl II和DNA连接 Msc I C和B 卡那霉素 X﹣Gluc 正常启动子P驱动gus基因在幼根及根毛中特异性表达，而缺失体中gus基因在根、叶和花粉均表达 M、Q

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定。

a.分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术。

b.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）①利用PCR技术扩增DNA的前提条件是要有已知核苷酸序列的目的基因，但正常启动子P左侧序列未知，因此不能直接根据片段Ⅰ扩增出正常启动子P。

②根据图1中环状DNA分子中的酶切位点可知，要得到环状DNA分子时，首先利用Bgl II酶切割片段Ⅰ，再用DNA连接酶处理使片段Ⅰ成为环状DNA。

③根据图1可知，将环状DNA用Msc I酶处理，得到片段Ⅱ。PCR反应中是从引物的3‘端开始合成新DNA链的，因此欲扩增出正常启动子P，需选用的引物组合为C和B。

（4）根据图3可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此导入烟草细胞中后，用含有卡那霉素的培养基对烟草细胞进行筛选，分别获得了含有正常启动子P及其4种缺失体（P1﹣P4）的转基因烟草。由于gus基因表达产物可将X﹣Gluc水解生成蓝色产物，因此将植物组织浸入适量X﹣Gluc溶液中，观察烟草细胞gus基因是否表达。实验结果表明正常启动子P驱动gus基因在幼根及根毛中特异性表达，而缺失体中gus基因在根、叶和花粉均表达；与P1﹣P4的实验结果相比，说明正常启动子P发挥不同功能的关键序列位于图2的M、Q。