题目内容
【题目】斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，研究人员构建了HuC基因的表达载体，并导入到斑马鱼细胞中研究其作用，请回答：
（1）为获取HuC基因，研究人员从早期胚胎神经细胞中提取HuC基因的mRNA，通过_________获得大量的DNA，进而构建出HuC基因的______________。
（2）DraⅢ， SnaBⅠ等是质粒上不同限制酶的切割位点。为获得HuC基因——绿色荧光蛋白基因的表达载体，需要对HuC基因和质粒选用图中的____________酶进行切割，这样做的原因是_________。不选择NotⅠ酶切割的原因是_____________。
（3）用Ca2+处理大肠杆菌，大肠杆菌细胞即能够______________。实验过程中可以采用在荧光显微镜下观察________________________或者在培养基中添加______________，筛选出导入表达载体的大肠杆菌。
【答案】逆转录和PCR技术扩增 cDNA文库 EcoRⅠ酶和BamHⅠ 可以防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接 破坏标记基因无法筛选（且没有启动子） 吸收周围环境中的DNA分子 表达的绿色荧光蛋白菌落 卡那霉素
【解析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）从早期胚胎神经细胞中提取HuC基因的mRNA，通过逆转录过程合成目的基因，并通过PCR技术在体外扩增可获得大量的目的基因，进而构建出HuC基因的cDNA文库。
（2）构建基因表达载体时，不能破坏运载体上的启动子、复制原点，以及运载体上需要保留标记基因，为了防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接，常用不同的限制酶切割质粒和目的基因，结合图示中各种限制酶的酶切位点可知，为获得HuC基因——绿色荧光蛋白基因的表达载体，需要对HuC基因和质粒选用图中的EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行切割。卡那霉素抗性基因为标记基因，若用NotⅠ酶切割，将会导致卡那霉素抗性基因被破坏，且切割后的质粒会失去启动子，使基因表达载体中缺少标记基因无法选择，且没有启动子无法转录，所以不选择NotⅠ酶切割质粒。
（3）用Ca2+处理大肠杆菌使之成为感受态细胞，易于吸收周围环境中的DNA分子。由于绿色荧光蛋白表达后会发绿光，所以实验过程中可以采用在荧光显微镜下观察表达的绿色荧光蛋白菌落或者在培养基中添加卡那霉素，筛选出导入表达载体的大肠杆菌。
