Question

【题目】I．基因工程操作步骤中，需要从受体细胞群中筛选出已获得目的基因的细胞，图中①-③示一种筛选方法的过程。pBR322质粒含有两个抗性基因，分别是Amp（氨苄青霉素）抗性基因和Tet（四环素）抗性基因，其中在Tet抗性基因上有下列目的基因的插入位点（插入将导致Tet抗性基因功能性失活），请回答：

（1）图中①过程所需的酶是___________________。

（2）经过①过程，pBR322质粒可能出现的两种结果A是_______________________。

（3）②过程表示用含四环素（使细胞停止生长，但不致死）和环丝氨酸（使生长的细胞致死）的培养基中培养细菌甲，则培养结果C表示在培养基中可能存活的细菌包括_________________。

（4）若要进一步筛选出符合要求的受体细胞D，则③过程需要做的处理是（请参照过程②的方法）___________________________________________________。

II．基因工程中使用的II型限制性核酸内切酶通常可以识别长度为4-8个核苷酸的特异序列。下面示限制酶Sau3A I对DNA片段切割的结果。

……CAATGATCTCCTA…… Sau3A I ……CAAT + GATCTCCTA……

……GTTACTAGAGGAT…… ……GTTACTAG AGGAT……

（5）请分析，Sau3AI的识别序列以及切割位点（用“↓”表示）是______________。

III．下表列出了几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1（含两个抗性基因的质粒）和图2（含目的基因的外源DNA）中箭头表示相关限制酶的酶切位点。

限制酶	XhoI	BclI	SalI	BamHI	XbaI
识别序列及酶切位点	C↓TCGAG	T↓GATCA	G↓TCGAC	G↓GATCC	T↓CTAGA

（6）据图1和图2分析，为了使目的基因和质粒实现定向连接和便于受体细胞的筛选，切割质粒的限制酶应选用_______________，切割含目的基因的外源DNA的酶应选用________________。

Answer 1

【答案】DNA连接酶（DNA连接酶和限制酶） 目的基因成功插入（重组质粒）、目的基因插入不成功（没有发生重组的质粒） 导入不成功的细菌和导入了重组质粒的细菌 将存活的细菌转移到含氨苄青霉素的培养基上培养 XbaⅠ和BclⅠ XbaⅠ和BclⅠ

【解析】

I．(1)图中①过程为构建基因表达载体过程，需要DNA连接酶和限制酶两种工具酶；

（2）经过②过程，pBR322质粒可能出现的两种结果，即A是两种质粒：重组质粒（目的基因成功插入）、没有发生重组的质粒（目的基因插入不成功）。

（3）②过程表示用含四环素（使细胞停止生长，但不致死）和环丝氨酸（使生长的细胞致死）的培养基中培养细菌甲，根据题干可知，在该培养基上成活的细菌是导入不成功的细菌和导入了重组质粒的细菌。

（4）若要进一步筛选出符合要求的受体细胞D，则③过程需要做的处理是：将存活的细菌转移到含氨苄青霉素的培养基上培养。

II．（5）据图分析可知，Sau3AI的识别序列以及切割位点是 。

III．（6）据图1和图2分析，为了使目的基因和质粒实现定向连接和便于受体细胞的筛选，切割质粒的限制酶应选用XbaⅠ和BclⅠ，切割含目的基因的外源DNA的酶应选用XbaⅠ和BclⅠ。