Question

【题目】融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如下图1。下图2是中间载体1和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位点标注于载体外侧），叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体 DNA的特定位点上。请回答下列问题：

（1）图1中，在第一阶段获得两种DNA的过程中，一般须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中。这是因为__________________________。加入到PCR反应体系的物质，除图中所示引物、模板DNA外，还应包括Mg2＋、扩增缓冲液、_________和_________________。

（2）图1中，在引物1、引物2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过__________次复制。引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生______________种双链DNA分子。

（3）图2中，构建成定点整合表达载体需用到的工具酶有______________和______________酶，图中定点整合表达载体上未标出的结构是 ________________________。

（4）利用定点整合表达载体将目的基因导入植物细胞的叶绿体中的优点是____________。

Answer 1

【答案】引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用 Taq酶 4种脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP） 2 4 SpeⅠ、 SalⅠ DNA连接酶 复制原点 能实现定点整合到叶绿体中，且不易随花粉扩散带来安全问题

【解析】

1、PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。

2、PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。

3、PCR需要的条件：引物、Taq酶、模板、脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

4、基因表达载体的构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用；组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因；根据图2显示，中间载体1的启动子一端有SpeI的切割位点和在终止子一端有SalI切割位点；并且“启动子-目的基因-终止子”这一段是插入在中间载体2的SpeI、SalI切割位点之间，因此构建如图的定点整合表达载体需使用SpeI、SalI和DNA连接酶。

（1）由于引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，故在第一阶段获得两种DNA的过程中，一般须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中；加入到PCR反应体系的物质，除图中所示引物、模板DNA外，还应包括Mg2+、扩增缓冲液和Taq酶和4种脱氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

（2）图1中，在引物1、引物2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制；引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生4种双链DNA分子。

（3）图2显示：启动子和终止子的两端分别有Spe I和Sal I的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在Spe I和Sal I的识别位点，因此图2中需使用Spe I、Sal I和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体；图中定点整合表达载体上未标出的结构是复制原点。

（4）综上在叶绿体定点整合表达载体中，叶绿体同源重组基因1和叶绿体同源重组基因2能使目的基因准确插入叶绿体DNA上的特定位点上。与利用农杆菌转化法相比，利用定点整合表达载体将目的基因导入叶绿体中的优点是：能实现定点整合到叶绿体中，且不易随花粉扩散带来安全问题。