Question

【题目】pBV220质粒是被广泛应用的大肠杆菌载体，结构如下图所示。其中PRPL是启动子，rrB是基因转录终止信号，Ampr是氨苄青霉素抗性基因，ori是质粒复制起点，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ均为限制性内切酶。回答下列问题：

（1）从图中可看出，pBV220作为运载体具备的条件有________________。

（2）将目的基因与此质粒构建基因表达载体时，通常用图中____________两种限制酶切割此质粒，其优点是______________________。用这两种酶可以切开此质粒的_____个磷酸二酯键，并且会____（填“消耗”或“产生”）同样数量的水分子。

（3）将构建好的基因表达载体导入大肠杆菌前，需用__处理大肠杆菌，使之成为________细胞，以提高转化效率。目的基因是否成功导入大肠杆菌，可采用___________进行检测。

Answer 1

【答案】 具有多个限制酶的切割位点、具有标记基因 EcoRⅠ、Hind Ⅲ 防止质粒切割后自身环化 4 消耗 Ca2+ 感受态 DNA分子杂交技术

【解析】试题分析：基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）从图中可看出，pBV220作为运载体具备的条件有具有多个限制性内切酶的切割位点（便于目的基因的插入）、标记基因（便于鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞）。

（2）将目的基因与此质粒构建基因表达载体时，通常用图中EcoRⅠ、HindⅢ两种限制酶切割此质粒，这两种酶切割产生的末端不同，可以防止质粒切割后自身环化。用这两种酶可以切开此质粒的4个磷酸二酯键，同时且消耗4个水分子。

（3）基因表达载体导入大肠杆菌前，需用Ca2+处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，以提高转化效率。目的基因是否成功导入大肠杆菌，可采用DNA分子杂交技术进行检测。