Question

5．白僵菌可感染农业害虫，常作为防治害虫的菌剂．由于白僵菌对除草剂草丁膦敏感且杀死害虫的能力较弱，科研人员对其进行基因工程改造，流程如图所示．

（1）苏云金芽孢杆菌产生的毒蛋白，能有效杀死害虫．已知该基因的全部序列，科研人员通过人工合成（或“化学合成”）法和PCR 技术获得大量毒蛋白基因片段．据图分析，将毒蛋白基因和质粒连接获得重组质粒l 的过程需要用到的工具酶是NcoI、BamHI和DNA连接酶．
（2）重组质粒1和Bar 基因（草丁膦抗性基因）各自用XbaI 酶处理，得到酶切片段．重组质粒l 的酶切片段再用去磷酸化酶处理，使端游离的磷酸基团脱离，目的是防止重组质粒1酶切片段自身连接（或“相互连接”）．将未用去磷酸化酶处理的Bar 基因与重组质粒1连接，获得重组质粒2．获得的重组质粒2的是如图中的C．

（3）将重组质粒2与感受态的白僵菌菌液混合进行转化，重组质粒2 在白僵菌细胞内被修复．一段时间后用含有草丁膦的平板培养基进行筛选，获得含有Bar 基因的重组白僵菌．
（4）提取上述重组白僵菌全部mRNA，加入逆转录酶，获得cDNA，再加入毒蛋白基因引物进行PCR 反应，用以检测毒蛋白基因是否完成了转录．
（5）科研人员将重组白僵菌喷涂于植物叶片上，以此饲喂饥饿处理的害虫，记录单位时间内的死亡害虫数，以判断重组白僵菌的杀虫效果．

Answer 1

分析 分析图解：图中首先利用NcoI、BamHI两种限制酶切割目的基因和质粒，然后再用DNA连接酶形成重组质粒，利用两种限制酶可以防止目的基因和质粒自身连接；
然后再利用XbaI 酶分别切割重组质粒1和Bar基因，再构建重组质粒2．

解答 解：（1）根据题意可知，已知该基因的全部序列，因此科研人员应通过人工合成（或“化学合成”）法和PCR技术获得大量毒蛋白基因片段．据图分析，将毒蛋白基因和质粒连接获得重组质粒l的过程需要用到的工具酶是NcoI、BamHI和DNA连接酶．
（2）利用同一种限制酶切割质粒和目的基因产生的黏性末端相同，这样容易导致质粒和目的基因自身环化．因此重组质粒1和Bar基因各自用XbaI酶处理，得到酶切片段．重组质粒l的酶切片段再用去磷酸化酶处理，使端游离的磷酸基团脱离，目的是防止重组质粒1酶切片段自身连接（或“相互连接”）．如果Bar基因未用去磷酸化酶处理，则形成的黏性末端两端都存在游离的磷酸集团；而重组质粒1利用了去磷酸化酶处理，两端没有游离的磷酸集团，因此将两者连接，获得重组质粒2，即两端都不能完全连接，如图中的C．
（3）将重组质粒2与感受态的白僵菌菌液混合进行转化，重组质粒2在白僵菌细胞内被修复．一段时间后用含有草丁膦的平板培养基进行筛选，获得含有Bar基因的重组白僵菌．
（4）提取上述重组白僵菌全部mRNA，加入逆转录酶，获得cDNA．由于mRNA是通过转录而来的，合成的cDNA也是特定的DNA，因此再加入毒蛋白基因引物进行PCR反应，用以检测毒蛋白基因是否完成了转录．
（5）科研人员将重组白僵菌喷涂于植物叶片上，以此饲喂饥饿处理的害虫，记录单位时间内的死亡害虫数，以判断重组白僵菌的杀虫效果．
故答案为：
（1）人工合成（或“化学合成”）     NcoI、BamHI和DNA连接酶
（2）重组质粒1 酶切片段自身连接（或“相互连接”）   C
（3）草丁膦
（4）逆转录  转录
（5）死亡害虫数

点评 本题考查了基因工程的有关知识，具有一定的综合性和难度，要求考生能够掌握基因表达载体构建的过程；识记基因工程的工具酶，并能够根据图示信息进行解题．