题目内容
【题目】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：
（1）基因工程的核心步骤是______________。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是__末端。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T﹣A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有__种不同DNA片段．
（4）在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加__的培养基进行培养．
（5）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是__识别与结合的位点，促进转录的开始．
【答案】基因表达载体的构建 平 4 抗生素B RNA聚合酶
【解析】
根据题干信息和图形分析可知，外源DNA含有MspⅠ、BamHI、MboI、SmaI4种限制性核酸内切酶的识别序列，其中限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点在目的基因D上；质粒含有MspⅠ、MspI、BamHI、MboI4种限制性核酸内切酶的识别序列，其中BamHI酶的切割位点位于抗生素A的抗性基因上；MboI酶的切割位点位于抗生素B和抗生素A的抗性基因上。
（1）基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
（2）SmaⅠ识别和切割位点是CCC↓GGG，因此若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是平末端。
（3）根据题意分析，杂合子的基因型为Dd，其中D基因片段有两个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp，发生基因突变后的d基因片段只有一个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段长度分别是1327bp、661bp，所以从杂合子中分离的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成会四种不同的DNA片段。
（4）用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养。
（5）基因表达载体上的启动子是RNA聚合酶的结合位点。
