Question

【题目】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

（1）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，其三段产物长度为_________________。

（2）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有__________种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过__________技术扩增目的基因，以获得大量的目的基因。

（3）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是__________。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般先用添加抗生素B的培养基进行培养，然后将生长的菌接种到只含__________的培养基中培养，可进一步筛选出含重组质粒的受体细胞。

（4）假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否用BamHⅠ?__________。为什么？____________________。

Answer 1

【答案】537bp、790bp、661bp 2 PCR BamHⅠ 抗生素A 不一定 因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处不一定出现GGATCC

【解析】

本题主要考察DNA重组技术的步骤，要求考生能准确把握限制酶的作用特点、标记基因的作用及重组质粒的筛选等知识点，并能从题图中提取有效信息，综合运用。

（1）限制酶SmaI的酶切割位点为CCC↓GGG，目的基因D的序列里面有两个该酶的酶切位点，故此段DNA会被切割成三段，从左至右第一段为534+3=537bp；第二段796-3-3=790bp；第三段658+3=661bp；

（2）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，基因D就突变为基因d，则基因d上只有一个限制酶SmaⅠ切割位点，被限制酶SmaⅠ切割的产物长度为534+796-3=1327kb、658+3=661bp，故隐性纯合子被限制酶SmaⅠ切割的产物中共有2种不同DNA片段。为了提高试验成功率，需要通过PCR技术扩增目的基因，以获得大量的目的基因。

（3）由图1可知目的基因两侧都有GGATCC序列，该序列可被限制酶BamHⅠ和MboⅠ的识别并切割；由图2质粒上的GGATCC序列可知，若选用MboⅠ切割，会将质粒中两个抗性基因（标记基因A、B）都破坏掉，故只能选用BamHⅠ（破坏抗生素A抗性基因，不破坏抗生素B抗性基因）。首先用含有抗生素B的培养基培养大肠杆菌，能生存下来的是含有普通质粒和重组质粒的大肠杆菌；再将培养的大肠杆菌接种在含有抗生素A的培养基培养，能生存下来的是含有普通质粒的大肠杆菌，通过对比分析即可得到含重组质粒的大肠杆菌。

（4）若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，不一定能用BamHⅠ，因为BamHⅠ的识别序列为GGATCC，而目的基因和抗生素B抗性基因拼接处不一定出现GGATCC。