Question

【题目】请阅读下文，分析回答下列问题

正常细胞中含有抑癌的P53基因，能表达抗病毒蛋白，帮助修复轻度变异的基因，也能使重复变异的细胞发生凋亡而避免肿瘤的发生；若它失活而不能表达，则基因突变的细胞易形成肿瘤。基因治疗肿瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖细胞和对人体基本无害而成为良好的基因载体。野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1，因此需要重新构建有疗效的、安全的腺病毒。图甲、乙中箭头所指为相应限制酶切点。

（1）DNA解旋酶直接作用于脱氧核苷酸之间的____________键（化学键）；DNA限制酶直接作用于脱氧核苷酸之间的____________键（化学键）。

（2）构建重组腺病毒时，限制酶最好选择______________，理由是：既可以去除_____基因以防止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏___________基因以防止其____________。

（3）将目的基因与腺病毒重组时，重组的成功率较低，依然还有大量非重组的野生型病毒的DNA，这是因为_____________________________________。

（4）要获得更多重组病毒，采用的方法是：获取人体某肿瘤细胞→将E1基因导入肿瘤细胞的基因组中→重组病毒侵染含E1基因的肿瘤细胞→体外培养侵染的细胞。该过程中利用肿瘤细胞能不断复制的特点可以为病毒提供更多的生活场所，那么选用含E1基因的肿瘤细胞进行重组病毒侵染的理由是____________________。筛选重组病毒，可采用离心分层纯化法，其依据是________________________________________。

（5）某DNA分子片段含有1000个碱基对。经扩增后，分别只用限制酶EcoRⅠ与同时用EcoRⅠ和HalⅢ两种方法切割，其电泳结果如图丙所示，可推断限制酶HalⅢ在该DNA片段上的切点有________________个。

（6）如果需将目的基因利用PCR技术扩增10次，则需要在缓冲液中至少加入[_____]个引物。

A．210 B． 210 +2 C．211 D．211-2

Answer 1

【答案】氢 磷酸二酯键 BamHI和ECORI E1 55kda 抑制P53基因的活性 DNA对所连接的DNA片段没有选择性，导致切下片段可能和原DNA连接 可以让病毒仅在含E1基因的肿瘤细胞中复制；而在不含E1基因的人体正常细胞中不能复制，提高安全性 重组病毒和非重组病毒分子量不同 2 D

【解析】

分析题图：图甲为野生型腺病毒DNA，其中含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1，因此构建基因表达载体时应破坏或去除55Kda基因和基因E1；图乙为人体DNA片段，其中P53基因为目的基因.要获得目的基因（P53基因），同时还要破坏或去除55Kda基因和基因E1，应选用EcoRI和BamHI切割载体和含有目的基因的DNA。

（1）DNA解旋酶直接作用于脱氧核苷酸之间的氢键；DNA限制酶直接作用于脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。

（2）根据题干信息“野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1”可知，构建基因表达载体时，应选用EcoRI和BamHI切割载体和含有目的基因的DNA，这样既可以去除E1基因以防止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏55Kda基因以防止其抑制P53基因的活性。

（3）由于DNA对所连接的DNA片段没有选择性，导致切下片段可能和原DNA连接，因此将目的基因与腺病毒重组时，重组的成功率较低，依然还有大量非重组的野生型病毒的DNA。

（4）选用含E1基因的肿瘤细胞进行重组病毒侵染，可以让病毒仅在含有E1基因的肿瘤细胞中复制，而在不含E1的人体正常细胞中不能复制，提高安全性.重组病毒与非重组病毒的DNA分子长度不同，质量（密度）也不同，因此筛选重组病毒时，可采用离心分层纯化法。

（5）只用限制酶EcoRI切割能产生700kb、200kb和100kb三种长度的DNA片段，同时用EcoRI和HalⅢ 两种酶切割可产生420kb、280kb和100kb三种长度的DNA片段，可见，限制酶HalⅢ又将长度为700Kb的DNA片段切成420kb和280kb两段，将长度为200kb的DNA片段切成10Okb的两段，由此可推断限制酶HalⅢ在该DNA片段上的切割位点有2个。

（6）利用PCR技术将目的基因扩增N次，至少需要的引物2N+1-2个。