[题目]禾谷镰刀菌可侵染小麦等作物.使其产量和品质下降.研究者通过构建融合基因 Ve-FG 并转化拟南芥.以期实现转基因植物抗禾谷镰刀菌的目的.(1)利用 PCR 技术.将野生番茄的抗黄萎病基因 Ve 与禾谷镰刀菌的识别基因 FG 进行重组.构建融合基因 Ve-FG(如图 1).① 设计 3 对引物.其中引物 2 的一部� 题目和参考答案——青夏教育精英家教网—

题目内容

【题目】禾谷镰刀菌可侵染小麦等作物，使其产量和品质下降。研究者通过构建融合基因 Ve-FG 并转化拟南芥，以期实现转基因植物抗禾谷镰刀菌的目的。

（1）利用 PCR 技术，将野生番茄的抗黄萎病基因 Ve 与禾谷镰刀菌的识别基因 FG 进行重组，构建融合基因 Ve-FG（如图 1）。

① 设计 3 对引物。其中引物 2 的一部分序列与 C 片段一部分序列互补，另一部分序列与_____片段一部分序列互补。

② 通过 PCR 分别克隆A、C、P 片段。克隆 A 片段应选用的引物是_____。

③ 以 A、C、P 片段为_____进行延伸，将 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 进行 PCR，扩增融合基因 Ve-FG。

（2）用_____将 Ve-FG 与质粒连接，构建重组质粒（如图 2，图中潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达）。将农杆菌与重组质粒混合，一段时间后涂布到含有_____的平板培养基上进行筛选。用含重组质粒的农杆菌转化拟南芥，几周后收获种子，种在含有潮霉素的培养基上，获得转基因拟南芥株系 1 和株系 2。

（3）分别提取株系 1 和 2、非转基因拟南芥植株叶片中的 DNA 作为模板，PCR 扩增 Ve-FG 基因后进行电泳，结果如图 3。

① 电泳时应以_____为阳性对照。

② 成功导入 Ve-FG 基因的是_____。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但电泳结果无阳性条带，原因可能是_____。

（4）为检验融合基因 Ve-FG 的功能，以导入 Ve-FG 基因的植株为实验组，导入空白质粒的植株为对照组，分别接种_____。一段时间后观察发现，与对照植株相比，实验组整体长势更旺盛，叶片萎蔫程度、叶片变黄程度也较轻，这表明_____。

【答案】P 1、3 模板 DNA连接酶卡那霉素融合基因 Ve-FG 株系 2 株系1中导入的是空白质粒，应空白质粒中也含有上述的两种抗性基因禾谷镰刀菌转基因拟南芥中的Ve-FG基因在拟南芥细胞中成功表达。

【解析】

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR过程为:变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

（1）① 设计 3 对引物。其中引物 2 的一部分序列与 C 片段一部分序列互补，另一部分序列与P片段一部分序列互补，才能实现图示的连接。

② 通过 PCR 分别克隆A、C、P 片段。选用的引物1、3可完成A 片段的克隆。

③ 以 A、C、P 片段为模板进行延伸，将 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 进行 PCR，扩增融合基因 Ve-FG。

（2）用DNA连接酶将 Ve-FG 与质粒连接，构建重组质粒（如图 2）。将农杆菌与重组质粒混合，由于重组质粒中含有抗卡那霉素的基因和潮霉素抗性基因，但是潮霉素抗性基因只在植物细胞中表达，因此，一段时间后将农杆菌涂布到含有卡那霉素的平板培养基上进行筛选，从而将经过转化的农杆菌筛选出来。用含重组质粒的农杆菌转化拟南芥，几周后收获种子，种在含有潮霉素的培养基上，从而将含有重组质粒的拟南芥株系 1 和株系 2筛选出来。

（3）分别提取株系 1 和 2、非转基因拟南芥植株叶片中的 DNA 作为模板，PCR 扩增 Ve-FG 基因后进行电泳，结果如图 3。

① 电泳时应以融合基因 Ve-FG为阳性对照。

② 成功导入 Ve-FG 基因的是株系2。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但电泳结果无阳性条带，原因可能是株系1导入的是空白质粒，从而不能急检测到目的基因。

（4）为检验融合基因 Ve-FG 的功能，以导入 Ve-FG 基因的植株为实验组，导入空白质粒的植株为对照组，分别接种禾谷镰刀菌。一段时间后观察发现，与对照植株相比，实验组整体长势更旺盛，叶片萎蔫程度、叶片变黄程度也较轻，这表明导入的Ve-FG基因在拟南芥细胞中成功表达。