Question

【题目】下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRⅤ酶切位点为，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为_______末端。

（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸，载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_______的脱氧核苷酸，形成P2，P2和目的基因片段在_______酶作用下，形成重组质粒P3。PCR技术中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是_____________________________________。

（3）PCR技术可以临床用于诊断感染性疾病、肿瘤及遗传病等，它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其标准步骤为_______、退火、__________。

（4）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了___________________。若该目的基因是从cDNA文库中分离获取的蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体中，然后在_______为唯一含碳营养物质的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

Answer 1

【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA 连接酶 耐高温 变性 延伸 鉴别和筛选含目的基因的细胞 蔗糖

【解析】

1、基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。其中标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素抗性基因。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。

2、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在识别序列的碱基的中轴线T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。

（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个胸腺嘧啶碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。由于在PCR扩增技术中采用高温使其变形解旋，因此需要使用的DNA聚合酶具有耐高温的特点。

（3）根据以上分析可知，PCR技术的标准步骤包括变性、退火、延伸。

（4）根据以上分析可知，重组质粒中抗生素抗性基因属于标记基因，其作用是鉴别和筛选含目的基因的细胞。根据题意可知，该目的基因是从cDNA文库中分离获取的蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体中，在个体水平上鉴定目的基因是否表达，可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中培养大肠杆菌，如果大肠杆菌细胞内目的基因表达出了蔗糖转运蛋白，该大肠杆菌能够进行正常的生长和繁殖，则说明目的基因完成了表达过程。