题目内容
【题目】为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
（1）获取α-淀粉酶基因后，对其进行克隆常采用的技术是_________。
（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_______端（填5’或3’）加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_______________
（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含______个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_______ 种。
（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液 | 50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 | 50 mmol/L Tris-HCl | 50 mmol/L Gly-NaOH | ||||||||||
pH | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 7.5 | 8.0 | 8.5 | 9.0 | 9.0 | 9.5 | 10.0 | 10.5 | |
酶相对活性% | 25.4 | 40.2 | 49.8 | 63.2 | 70.1 | 95.5 | 99.5 | 85.3 | 68.1 | 63.7 | 41.5 | 20.8 | |
根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为_________________________ 。
【答案】PCR 5’ 使DNA片段能定向插入表达载体，并减少自连 ② ⑥ 8 13 pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl
【解析】
图示为基因工程操作过程：①目的基因（α-淀粉酶基因）和表达载体的制备，②目的基因和表达载体构成重组DNA分子，③重组DNA分子导入受体细胞，④目的基因的筛选和鉴定。
（1）PCR是常用的体外扩增技术，能将微量的α-淀粉酶基因大幅增加。
（2）因延伸是在引物的3’端进行，因此需要在5’端加上限制性酶切位点，为使DNA片段能定向插入表达载体，并减少自连，通常需要在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
（3）进行扩增时，②退火温度促进引物与该模板DNA单链重新配对，⑥延伸时间与扩增片段的长度有关。
（4）mRNA分子三个相邻的碱基称为一个密码子，虚线框内mRNA片段包含24个碱基，8个密码子，线框后的第一个碱基是U，第二、三位的碱基都有4种可能性，因此共有44=16种密码子，因不可能是3种终止密码子，虚线框后的第一个密码子最多有16-3=13种。
（5）依图可知：在pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下，α-淀粉酶相对活性最高。
