题目内容
【题目】图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因（抗冻基因）番茄的示意图，外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因，请回答下列问题。
（1）图甲中通常选用质粒C构建重组质粒，而不选用质粒A或质粒B的原因分别是____。
（2）据图乙分析，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶______________切割目的基因和质粒。
（3）在构建基因表达载体过程中常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在目的基因上游。双启动子的作用可能是___________________________________。
（4）图乙农杆菌中的质粒应含有T-DNA，其作用是___________。若要获得抗冻能力更强的抗冻番茄，可以对AFPs基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到________工程。
（5）为使改造后的AFPs基因能够表达，人工设计质粒D并对它的多个酶切位点进行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位点为计算起点，则KpnⅠ酶切割位点与HindⅢ酶切割位点最短长度为______。
【答案】质粒A中没有标记基因，质粒B的复制原点中含有HindⅢ酶切位点 BamHⅠ和HindⅢ 保证目的基因的高效转录（高效表达） 携带目的基因进入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA 蛋白质 750bp
【解析】
1.基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
3.蛋白质过程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
(1)质粒A缺乏标记基因，质粒B的复制原点中含有限制酶切割位点，可能会破坏复制原点，质粒C含有多个标记基因和酶切位点，适宜作为基因工程的载体。
（2）图乙中，选用的质粒C作为基因工程的载体，结合目的基因两端的酶切位点，目的基因和载体可以选择BamH'和Hind 1同时切割，或者EcoR'和Hindll同时切割，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶BamHI (会破坏Tc) 和HindIl切割，可以根据是否对四环素有抗性来筛选。
（3）启动子是RNA聚合酶结合的位点，是起始转录的位点，双启动子可能是保证目的基因的高效转录（高效表达）。
（4）农杆菌转化法中的Ti质粒含有的T-DNA可以携带目的基因进入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA中。若要获得抗冻能力更强的抗冻番茄，可以对AFPs基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程是通过设计蛋白质序列推测相关的基因序列，进而对AFPs基因进行改造，然后用改造后的基因指导更强抗冻蛋白的合成来完成的，该过程属于蛋白质工程范畴。
（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。说明EcoRI酶有2个酶切位点，且两.个位点之间的最短距离是500bp，而KpnI酶的切点在2个EcoRI酶切点之间，且距离每个EcoRI酶切点250bp，HindⅢ酶切点距离最近的EcoRI酶切点的最短距离是500bp，距离另一个EcoRI酶切点的距离是500+500=1000bp。故KpnI酶切割位点与HindIII酶切割位点最短长度250+500=750 bp。
