Question

【题目】图甲表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图乙表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、 BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

【1】用图甲中的外源DNA（含有目的基因D）和图乙中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和______________________________。前者（酶）的专一性很强，其作用特点是________________________________________。

【2】应该使用限制酶BamH Ⅰ同时处理质粒外源DNA，而不选择其他3种，原因在于（ ）

A.若使用Sma Ⅰ或者Msp I会破坏目的基因。

B.若使用Sma Ⅰ切割质粒，能成功切开质粒得到粘性末端的可能很低。

C.若使用Mbo Ⅰ切割质粒，质粒上会有2处被切开，会将质粒切成两段不利于筛选。

D.使用限制酶BamH Ⅰ能保证目的基因和质粒获得相同的粘性末端，以便目的基因和运载体定向连接，不至于反向连接。

E.使用BamH Ⅰ切割质粒质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞。

F.只有使用BamH Ⅰ切割，才能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端。

【3】若图甲中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图甲及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有_________种不同DNA片段。若同时用限制酶Msp Ⅰ、Mbo Ⅰ切割图乙中的质粒，则可得到__________个DNA片段。

【4】为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，一般可进行如下步骤筛选：

第一步：将大肠杆菌在含__________的培养基上，得到如下左图的菌落。

第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含__________的培养基上培养，得到如下右图的结果（空圈表示与左图对照无菌落的位置）。

第三步：选出左图培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的大肠杆菌。请在下方左图中圈出含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落__________。

【5】以上筛选方式至少需要两步，其实还有其他更简单的操作方法。请阅读下列材料，回答问题：

大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯酶切序列，位于该质粒的lacZ基因中。lacZ基中如果没有插入外源基因，便可表达出β一半乳糖苷酶。当培养基中含有A物质时，A物质便会被β一半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β一半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落。pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因。下图是利用a基因筛选重组质粒示意图。

用下图中的培养基中筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌，制备时除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外还应加入物质应包括（ ）

A.伊红美蓝试剂B.琼脂C.A物质D.氨苄青霉素

【6】将上述处理后的大肠杆菌置于图中培养基上培养，以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒，结果可能出现蓝色或者白色菌落，其中__________色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌。

Answer 1

【答案】

【1】 DNA连接酶 能够识别特定的碱基序列并加以切割

【2】ACE

【3】 4 3

【4】 抗生素B 抗生素A

【5】BCD

【6】白

【解析】

基因工程中需要使用的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体，其中限制性核酸内切酶的特点是能够识别特定的碱基序列并加以切割。对目的基因和运载体进行处理时需要选择可以产生相同粘性末端的限制酶，同时要保证运载体上标记基因的完整，以便后续进行检测。

【1】用图甲中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和DNA连接酶；限制酶的专一性很强，其作用特点是能够识别特定的碱基序列并加以切割；

【2】A、若使用SmaⅠ或者MspⅠ会从目的基因的内部切割，会破坏目的基因，A正确；

B、之所以不用SmaⅠ限制酶，原因是这种酶切割目的基因会破坏目的基因，同时利用这种酶切割质粒，不可能得到粘性末端，B错误；

C、若使用MboⅠ切割质粒，由于其识别的序列为GATC，质粒上会有2处被切开，并且导致两个抗性基因均会被破坏，这将不利于筛选，C正确；

D、使用限制酶BamHⅠ切割目的基因和质粒，使目的基因和质粒获得相同的粘性末端，但这会导致目的基因和运载体反向连接，D错误；

E、使用BamHⅠ切割质粒，观察质粒上的识别序列可以发现，质粒上会有1处被切开，导致抗生素A抗性基因被破坏，保留抗生素B抗性基因，这样便于将来筛选含目的基因的受体细胞，E正确；

F、利用BamHⅠ或MboⅠ切割，能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端，F错误；

故选ACE；

【3】杂合子的基因型为Dd，其中D基因片段有两个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537bp、790bp、661bp，发生基因突变后的d基因片段只有一个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段长度分别是1327bp、661bp，所以从杂合子中分离的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成会4种不同的DNA片段；限制酶MspⅠ在质粒上存在一个酶切位点，而限制酶MboⅠ在质粒上存在于两个酶切位点，因此同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到3个DNA片段；

【4】分析图解可知，该基因工程中，最好选择限制酶BamHⅠ切割目的基因和质粒，但是利用该酶切割将会破坏抗生素A抗性基因，则抗生素B抗性基因为重组质粒中的标记基因，在筛选过程中，首先让大肠杆菌在含抗生素B的培养基上培养，得到图3的菌落是含有目的基因及抗生素B抗性基因的菌落；再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含抗生素A的培养基上培养，得到图4的结果，则图4中的菌落是既含抗生素B抗性基因又含有抗生素A抗性基因的菌落，所以选出图3中有但图4中对应部位没有的菌落进行培养，就可以得到含重组质粒的大肠杆菌，如图。

【5】根据题意可知，pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因，因此制备培养基时需要加入氨苄青霉素进行筛选，同时还需要加入琼脂作为培养基的凝固剂，A物质用于鉴定lacZ基因是否被破坏；

故选BCD。

【6】如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落，因此其中白色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌。

该题的难点为确定限制酶的识别序列从而合理的对目的基因和运载体进行切割和重组操作，该过程需要学生认知要保证目的基因的完整性，保证质粒上至少一个标记基因的完整性和目的基因与运载体的合理连接，考察学生对基因工程的综合掌握情况。