Question

【题目】VNN1基因（1542bp）与炎症相关性疾病有关，GFP基因（4735bp）控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光。某研究小组进行鼠源GFP - VNNI重组质粒的构建及其功能研究，回答下列问题：

（l）为构建重组质粒，研究小组从数据库查找到VNNl的DNA序列，并设计引物。上游引物：5-AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC-3下划线为HindⅢ酶切位点），下游引物：5-GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA-3（下划线为BamHI酶切位点），之后进行PCR扩增，PCR的原理是________。扩增后的VNNI基因要与含GFP基因的载体连接，需用________（填具体酶）切割VNNI基因和含GFP基因的载体，再用________酶处理，构建重组质粒。

（2）GFP基因在重组质粒中可作为________________，其作用是________。用之前相同的限制酶对GFP - VNNI重组质粒切割后，进行电泳鉴定时得到如图1所示的部分条带，结果表明________。

（3）IL -6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应。图2为GFP-VNNI重组质粒对细胞分泌IL -6的影响，由此说明________________，同时发现与正常组比较，空质粒转染组IL-6的表达有轻微升高，造成这种现象的可能原因是________________________。

Answer 1

【答案】DNA双链复制 HindⅢ酶和BamHⅠ酶 DNA连接 标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来 VNN1基因已插入到含GFP基因的载体中（合理即可） VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL-6 操作过程中对细胞的损伤（或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用），可以激活相应细胞分泌炎症因子IL-6

【解析】

基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的获取：原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

第二步：基因表达载体的构建

第三步：将目的基因导入受体细胞

常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和 花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术；

将目的基因导入微生物细胞：先用 Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

第四步：目的基因的检测和表达。

（1）PCR的原理是DNA双链复制，为防止切割的质粒环化，通常选择两种的限制酶进行切割，同时需要用相同的限制酶对目的基因进行处理，所以选择HindⅢ酶和BamHI切割VNNI基因和含GFP基因的载体，再用DNA连接酶处理形成重组质粒。

（2）GFP基因（4735bp）控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光，所以在重组质粒中可以作为标记基因；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来；电泳条带显示分子量增加表明VNN1基因已插入到含GFP基因的载体中。

（3）从柱状图中看出VNN1组中IL-6的浓度增加，说明了VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL-6；空质粒转染组IL-6的表达有轻微升高，可能原因是操作过程中对细胞的损伤（或用到的化学试剂对细胞具有一定的毒性作用），可以激活相应细胞分泌炎症因子IL-6。