Question

【题目】我国一科研团队将小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：

（1）获取目的基因的方法很多。若TaNHX2基因序列未知，怎样从已构建好的基因文库（大肠杆菌作为受体细菌）中获取含TaNHX2基因的菌株？______________________________。若已知TaNHX2基因序列，可以用PCR扩增该基因。首先根据序列设计、合成__________并投入PCR反应体系，同时，还需要放入dNTP、目的基因、Taq酶等。还可以人工合成TaNHX2基因，如图1表示人工合成了两条若干个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA。从功能看，Klenow酶是一种__________酶。

（2）图2是3种限制酶的识别与酶切位点示意图，构建基因表达载体的时候，经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与图3所示质粒被__________酶切后的产物连接，理由是____________________。连接后的重组质粒__________（填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。

（3）基因表达载体通过农杆菌转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其__________，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

Answer 1

【答案】使用高盐浓度的培养基进行筛选，能生存的菌株即含TaNHX2基因的菌株引物DNA聚合BamHⅠ和Sau3AⅠ两种酶切割片段产生的黏性末端互补不一定插入到植物细胞的染色体DNA上

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）根据题干信息分析可知， TaNHX2基因为Na+/K+逆向转运蛋白基因，说明TaNHX2基因能控制生物的耐盐性状，因此应该使用高盐浓度的培养基进行筛选，能生存的菌株即含TaNHX2基因的菌株。PCR技术扩增目的基因的前提条件是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。根据题意和图示分析，Klenow酶可以将DNA的单链区补平，获得双链DNA，说明Klenow酶是一种DNA聚合酶。

（2）根据图2分析，BamHⅠ酶和Sau3AⅠ酶切割后漏出来的粘性末端相同，可以互补配对，因此构建基因表达载体的时候，经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与图3所示质粒被BamHⅠ和Sau3AⅠ两种酶切后的产物连接。若质粒被Sau3AⅠ酶切割后与目的基因相连，则产生的碱基序列不同于BamHⅠ酶的识别序列，因此连接后的重组质粒不一定能被BamHⅠ切割。

（3）采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞时，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。