题目内容
【题目】L-肉碱具有参与脂肪氧化、抗疲劳、延迟患阿尔茨海默综合症等功能。据报道大肠杆菌能将巴豆甜菜碱转化成L-肉碱，但效率较低。科研人员通过基因工程将BCD基因、F基因以及T基因导入到大肠杆菌细胞内以提高L-肉碱的转化率。实验过程及结果如下图所示，分析并回答下列问题：
Kan 卡那霉素抗性基因
CAT 氯霉素抗性基因
（1）实验过程中用PCR技术获得目的基因，PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和____________。实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入到大肠杆菌细胞内，而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌，原因是____________，并能遗传给下一代.图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7，T7是____________识别和结合的部位，能驱动基因转录。
（2）将重组所粒1和重组质粒2导入大肠杆菌时，应用________处理大肠杆菌，使细胞处于____________________的感受态。
（3）为了筛选出同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌，实验的思路是______________。
（4）研究发现巴豆甜菜碱转化成L-肉碱是一个可逆反应过程，得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后，L-肉碱的含量基本稳定，此时可以____________________，使反应向生成L-肉碱的方向进行，以提高产量。
【答案】（两种）引物 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能够得以表达（使目的基因在受体细胞中完成转化） RNA聚合酶 Ca2+ 易于吸收周围环境中DNA分子 在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选能生长的大肠杆菌菌落 及时移除产物（更换培养液）
【解析】
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）多聚酶链式反应（PCR），是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和（两种）引物。由于目的基因无法直接在受体细胞中表达，因此为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，能够表达，实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入到大肠杆菌细胞内，而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌。并能遗传给下一代。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7，T7是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。
（2）使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用Ca2+处理，使细胞处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，使含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。
（3）重组质粒1上含有BCD基因、T基因及卡那霉素抗性基因，重组质粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因，因此在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选单克隆大肠杆菌，就是同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌。
（4）研究发现巴豆甜菜碱转化成L-肉碱是一个可逆反应过程，在可逆反应中，减少生成物浓度，可使反应向正方向进行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后，L-肉碱的含量基本稳定，此时可以及时移除产物（更换培养液），使反应向生成L-肉碱的方向进行，以提高产量。
