Question

【题目】科研人员运用两种方法分离杜氏盐藻、球等鞭金藻细胞的叶绿体，并提取叶绿体DNA，主要实验步骤和结果如下，其中SDS能瓦解生物膜，氯仿异戊醇不溶于水且密度均大于水，DNA不溶于氯仿异戊醇。请回答：

步骤①收集藻细胞：将两种藻细胞培养液进行预处理后，离心取沉淀物。

步骤②获取叶绿体粗：提物4℃下分别破碎两种藻细胞后，再分别用差速离心法和密度梯度离心法分离获取叶绿体粗提物(原理示意图如下)。

步骤③去除杂质DNA：向步骤②的叶绿体粗提物中加入DNA酶、缓冲液，37℃静置15min后，离心取沉淀物。

步骤④粗提叶绿体DNA：向步骤③获得的叶绿体中加入缓冲液、SDS、蛋白酶K，60℃水浴2h，离心取上清液。再向上清液中加入氯仿异戊醇，在4℃下离心取　？　。

步骤⑤纯化叶绿体DNA：向粗提溶液中加入3mol·L－1醋酸钠及预冷的95%酒精，低温静置1h后，离心弃上清液。加预冷的95%酒精、离心洗涤1～2次，取沉淀物用超纯水溶解。

步骤⑥DNA纯度和浓度：测定利用分光光度法测量并计算叶绿体DNA的纯度及浓度，结果如上右表(表中OD260/OD280值越接近1.8说明DNA越纯)。

(1)步骤①中预处理时应将藻液置于____处24h，以降低叶绿体中淀粉粒的含量，有利于分离得到完整叶绿体。步骤②在利用差速离心法分离获得叶绿体前，需要先在____(填“低于”“等于”或“高于”)4 000r·min－1下离心去除细胞壁、核物质等。

(2)步骤③依据的主要原理是____，去除的“杂质DNA”来源于____。

(3)步骤④中离心后应取____。步骤⑤中用95%的冷酒精离心洗涤过程要注意动作轻缓，其目的是____________________________________________________________。

(4)根据实验结果分析，____法较适于分离提取叶绿体DNA，原因是_________________________________________。

Answer 1

【答案】黑暗 低于 DNA酶能催化DNA水解 细胞核 上清液 防止叶绿体DNA断裂 差速离心 获得的叶绿体DNA数量多且纯度高

【解析】

根据题干信息分析。该实验的目的是利用差速离心法和密度梯度离心法对杜氏盐藻、球等鞭金藻细胞的叶绿体进行分离，并提取叶绿体DNA。据图分析，差速离心法的原理是利用不同的转速分离细胞匀浆中的各种物质或结构，最终获得叶绿体，因此图中的“？”应该是不同于后面的转速的；蔗糖密度梯度离心法的结果是小颗粒、中等颗粒和大颗粒分别位于试管的不同位置。

（1）为了降低叶绿体中淀粉粒的含量，有利于分离得到完整叶绿体，步骤①中预处理时应该应将藻液置于黑暗处24h。

（2）步骤③中加入的DNA酶能够将DNA水解，进而达到去除杂质DNA的目的；步骤②离心获得的是细胞壁、核物质等，因此该杂质DNA来源于细胞核。

（3）步骤④为粗提叶绿体DNA，离心取上清液并加入氯仿异戊醇，而DNA不溶于氯仿异戊醇，因此在4℃下离心取的是上清液。步骤⑤中用95%的冷酒精离心洗涤过程要注意动作轻缓，以防止叶绿体DNA断裂。

（4）根据题意分析，已知OD260/OD280值越接近1.8说明DNA越纯，则表格数据显示，差速离心法获得的叶绿体DNA数量多且纯度高，比较适于分离提取叶绿体DNA。