题目内容
【题目】酿酒酵母不能利用木糖制约了利用植物原料生产乙醇的经济效益。木酮糖激酶是木糖转化、利用的关键酶，为提高酵母细胞中木酮糖激酶的表达量，科研人员将两种启动子与木酮糖激酶基因结合并导入酿酒酵母细胞，构建能同时利用葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母。下左图表示相关研究过程，右表是几种限制性内切酶的识别序列及切割位点。请回答：
限制酶 | 识别序列和 |
切割位点 | |
EcoRⅠ | G↓AATTC |
BamHⅠ | G↓GATCC |
HindⅢ | A↓AGCTT |
XhoⅠ | C↓TCGAG |
NdeⅠ | CA↓TATG |
SalⅠ | G↓TCGAC |
(1)重组质粒中终止子的作用是____。表中切割DNA后形成相同黏性末端的限制性内切酶是____，黏性末端为____。
(2)过程③使用的限制性内切酶是________。过程⑤需先用LiAc处理酿酒酵母细胞，其目的是__________，使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。
(3)结合图示分析，进行工程菌筛选时，在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒的酿酒酵母，这是因为____________。
(4)研究人员对筛选得到的两种重组酵母(甲中导入启动子A，乙中导入启动子B)细胞中木酮糖激酶活力及发酵乙醇得率进行比较(发酵条件：1 L 15 g·L－1的葡萄糖和50 g·L－1的木糖培养基中，120 h)结果如下表。
从木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的结论是启动子A的功能比启动子B____，但本实验中乙醇得率相差不大，其可能的原因是___________________________________________。
【答案】使转录终止(或使RNA聚合酶与模板分离) XhoⅠ与SalⅠ —AGCT(或TCGA—) EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ 增大酵母细胞的通透性 普通质粒上有抗四环素基因，导入普通质粒的酵母也能在含四环素的培养基上生长繁殖 弱 实验中发酵时间过长(或培养基中的葡萄糖和木糖含量过少)
【解析】
基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因，其中启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度；终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。
（1）重组质粒的组成成分包括启动子、终止子、目的基因和标记基因，其中终止子的作用是使转录终止；根据表格分析，不同的限制酶识别和切割的位点不同，其中XhoⅠ与SalⅠ切割DNA后形成黏性末端是相同的，都是—AGCT(或TCGA—)。
（2）据图分析，过程③含有启动子A的目的基因两侧的限制酶切割位点是EcoRⅠ、BamHⅠ，且质粒上也有这两种限制酶切割位点，而且没有破坏标记基因，因此过程③使用的限制性内切酶是EcoRⅠ、BamHⅠ；过程⑤需先用LiAc处理酿酒酵母细胞，增大了酵母细胞的通透性，使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。
（3）由于重组质粒和普通质粒上都有抗四环素基因，则导入普通质粒的酵母和导入重组质粒的酵母菌都能在含四环素的培养基上生长繁殖，因此在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒的酿酒酵母。
（4）根据表格数据分析，重组酿酒酵母乙的木酮糖激酶酶活力远远高于重组酿酒酵母甲的木酮糖激酶酶活力，说明启动子A的功能比启动子B弱；但本实验中乙醇得率相差不大，可能是因为实验中发酵时间过长(或培养基中的葡萄糖和木糖含量过少)。
