Question

14．白细胞介素-1（IL-1）是重要的炎性介质之一，也是一种热原质成分，具有致热和介导炎症的作用．它主要在细胞免疫激活中发挥调节作用．某项目小组利用基因工程技术大量合成IL-1，在pBV220载体（图A）多克隆位点的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间插入目的基因IL1-His，构建表达载体pBV-IL1-His（图B）．转化感受态细胞（大肠杆菌），通过选择性培养基（Amp^r）和菌体PCR法筛选重组子阳性克隆．在适宜条件下培养并诱导目的蛋白的表达，最后利用His抗体进行蛋白质印迹检测表达情况．
（1）在上述实验中，为了防止目的基因和pBV220载体在酶切后的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ．目的基因的长度为487pb（重组质粒上目的基因的插入位点与酶切位点之间的碱基对忽略不计）．pBV-IL1-His表达载体除了氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）、目的基因外还必须具有启动子、终止子等基因．
（2）转化感受态大肠杆菌时需要用Ca²⁺处理细胞．利用PCR技术体外扩增DNA时，需将双链DNA加热到90℃以上，目的是使双链DNA变性，解聚为单链．
（3）最后是通过抗原-抗体杂交技术来检验实验是否成功．假设未检测出目的蛋白，分析可能的原因有目的基因在受体细胞中没有表达．（写出一种即可）

Answer 1

分析 1．基因工程的工具酶是限制酶和DNA连接酶，一种限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成粘性末端或平末端；
2．DNA连接酶只能连接相同的粘性末端，若用同种限制酶切割，则容易形成质粒或目的基因自身环化的结构；
3．构建基因表达载体时，必须包含目的基因、标记基因、启动子、终止子及复制原点等结构．

解答 解：（1）根据题意：在pBV220载体（图A）多克隆位点的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间插入目的基因IL1-His，构建表达载体pBV-IL1-His（图B），故为了防止目的基因和pBV220载体在酶切后的末端发生任意连接，导致自身环化，酶切时应选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ；根据图示，为插入前的载体为3666bp，但插入目的基因之后的长度为4153bp，故目的基因的长度为4153-3666=487bp；构建基因表达载体时，必须包含目的基因、标记基因（氨苄青霉素抗性基因）、启动子、终止子等结构．
（2）将目的基因导入细菌等微生物的方法是感受态细胞法，转化感受态大肠杆菌时需要用Ca²⁺处理细胞；利用PCR技术体外扩增DNA时，不需要加入解旋酶，原理是DNA的热变性，将双链DNA加热到90℃以上，目的是使双链DNA变性，解聚为单链．
（3）基因工程的最后一步是目的基因的检测与鉴定，检测目的基因是否表达成相应的蛋白质，方法是抗原-抗体杂交技术；假设未检测出目的蛋白则目的基因表达不成功，原因可能是目的基因在受体细胞中没有表达．
故答案为：
（1）EcoRⅠ和BamHⅠ487      启动子、终止子
（2）Ca²⁺使双链DNA变性，解聚为单链
（3）抗原-抗体杂交     目的基因在受体细胞中没有表达

点评 本题重点考查基因工程的有关知识，要求掌握基因工程的操作步骤及在生产实践中的运用；能够对基因工程中DNA片段的长短进行简单的计算，难度适中．