Question

15．“基因敲除”是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术，该技术采用基因工程等手段使模型动物体内的某一基因失去功能，以研究该基因在生物个体发育和病理过程中的作用．例如基因型为BB的小鼠，要敲除基因B，可先用体外合成的突变基因b取代正常基因B，使BB细胞改变为Bb细胞，最终培育成为基因敲除小鼠．请回答：
（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，基因b是否导入受体细胞，可利用重组质粒上的标记基因检测．
（2）利用PCR技术扩增目的基因时，在反应体系中需要加入DNA模板（目的基因）、引物、热稳定DNA聚合（Taq）酶、脱氧核苷酸、缓冲液等
（3）题中获得的基因敲除小鼠，不能（填“能”或“不能”）直接用来研究B基因的功能，原因是该基因敲除小鼠只敲除了一个B基因，还有一个B基因行使功能，因此无法判断此基因的功能．
（4）目的基因与载体结合过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶．已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是-G→GATCC-，请画出目的基因被该限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，其中标记基因的作用是检测目的基因（基因b）是否导入受体细胞．
（2）利用PCR技术扩增目的基因的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．
（3）题中获得的基因敲除小鼠，只敲除了一个B基因，还有一个B基因行使功能，因此不能直接用该基因敲除小鼠来研究B基因的功能．
（4）目的基因与载体结合过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶．已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是-G→GATCC-，则目的基因被该限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端为．
故答案为：
（1）基因表达载体的构建      标记基因
（2）DNA模板（目的基因）      热稳定DNA聚合（Taq）
（3）不能      该基因敲除小鼠只敲除了一个B基因，还有一个B基因行使功能，因此无法判断此基因的功能
（4）DNA连接

点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合题中信息准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查．