Question

【题目】血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

（1）将实验流程补充完整：A为_____，凝胶色谱法是根据_____来分离蛋白质的有效方法。

（2）洗涤红细胞的目的是去除_____。洗涤干净的标志是_____。释放血红蛋白的过程中起作用的物质有_____。

（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是_____。

（4）在装填色谱柱时不得有气泡存在，因为_____。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干、露出凝胶颗粒的情况，一旦发生这种情况，需重新装填凝胶色谱柱。如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

Answer 1

【答案】血红蛋白的释放 相对分子质量的大小 杂蛋白（血浆蛋白） 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯 准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

【解析】

1、血红蛋的提取与分离的实验步骤主要有(1)样品处理：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析；（2）粗分离；（3）纯化：凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的装填→样品的加入和洗脱；（4）纯度鉴定——聚丙烯酰胺胶电泳。

2、凝胶色谱法的原理是：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。所以凝胶色谱法是根据相对分子质量大小而达到蛋白质分离的有效方法。

3、洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，释放血红蛋白的过程是让红细胞吸水涨破。如果分层不明显，可能是洗涤次数少，无法除去血浆蛋白。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净，因为甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂。释放血红蛋白的过程中起作用的是蒸馏水和甲苯。

4、磷酸缓冲液（PH为7.0)能够准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀一致地移动，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

据分析可知：

（1）将实验流程补充完整：A为血红蛋白的释放，凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法。

（2）洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白（血浆蛋白）。洗涤干净的标志是离心后的上清液中没有黄色。释放血红蛋白的过程中起作用的物质有蒸馏水和甲苯。

（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致。

（4）在装填色谱柱时不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。