Question

5．基因工程
pUC18是基因工程中常用的质粒运载体，其结构如图1（其中HindⅢ、PstⅠ、EcoRⅠ等限制酶的识别位点之间的碱基对数忽略不计，lacZ是显色基因）．

现将扩增的含目的基因的外源DNA片段与pUC18质粒都用PstI进行酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒．为筛选非重组子和重组子，分别用不同的限制酶进行酶切．经琼脂糖凝胶电泳结果如图1（1kb=1000对碱基）．请据图分析回答：
（1）与pUC18质粒重组的目的基因大小为4kb．
（2）用kpnⅠ酶切pUC18质粒，产生了1条2.7kb的带；用kpnⅠ酶切重组质粒，产生了2条带，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb两组数据（图2）．下列说法中合理的是AC（多选）
A．重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点，且其中一个位于目的基因的区段
B．重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点，都位于目的基因的区段
C．产生两种酶切的结果，推测是目的基因与开环的pUC18拼接时有两种可能的插入方向
D．产生两种酶切的结果，推测是另有一种限制酶的酶切位点的碱基序列与kpnⅠ相同
（3）请在目的基因上标注kpnⅠ酶切位点（需注明目的基因的碱基对数量及kpnⅠ酶切位点两侧的碱基对数量）

（4）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落．反之，则形成白色菌落．选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加X-gal、IPTG、氨苄青霉素入物质．成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成白色颜色的菌落，原因是lacZ基因被插入目的基因而失活．

Answer 1

分析 分析题图：用HindⅢ或EcoRⅠ切割后，pUC18质粒只产生1条2、7kb的带，重组子产生了2条带，即4.0kb和2.7kb，非重组子产生1条带，即2.7kb．用kpnⅠ酶切pUC18质粒，产生了1条2.7kb的带；用kpnⅠ酶切重组质粒，产生了2条带，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb两组数据，说明重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点，且其中一个位于目的基因的区段，产生两种酶切的结果的原因可能是目的基因与开环的pUC18拼接时有两种可能的插入方向．据此答题．

解答 解：（1）根据图1可知，pUC18质粒的长度是2.7kb，而重组子的长度是2.7+4.0=6.7kb，因此与pUC18质粒重组的目的基因大小为4kb．
（2）AB、pUC18质粒的长度是2.7kb，目的基因大小为4kb，用kpnⅠ酶切重组质粒，产生了2条带，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb两组数据，这说明重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点，且其中一个位于目的基因的区段，A正确，B错误；
CD、产生两种酶切的结果，推测是目的基因与开环的pUC18拼接时有两种可能的插入方向，C正确，D错误．
故选：AC．
（3）用kpnⅠ酶切重组质粒，产生了2条带，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb两组数据，说明重组质粒中有两个kpnⅠ的酶切位点，且其中一个位于目的基因的区段，目的基因上标注kpnⅠ酶切位点如图：．
（4）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落．反之，则形成白色菌落．培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质包括碳源、氮源、无机盐、水和生长因子．由于质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此导入质粒的大肠杆菌能抗氨苄青霉素，所以培养基中还应加入氨苄青霉素，作用是筛选出导入pUC18质粒的大肠杆菌，此外培养基中还应加入IPTG、X-gal．重组质粒上的LacZ基因被破坏，不能产生β一半乳糖苷酶，若大肠杆菌中已成功导入了重组质粒，则其在含有IPTG和X-gal的培养基中形成白色菌落．
故答案为：
（1）4
（2）AC
（3）

（必须正确标出酶切位点距离一端的碱基数才给分，也可标于左侧．）
（4）X-gal、IPTG、氨苄青霉素    白色    lacZ基因被插入目的基因而失活

点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，能正确分析题图，并结合图中信息准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查．