Question

【题目】某些膜内蛋白以紧密排列的方阵形式存在称为OAPs，OAPs的分布异常与某些神经性和神经肌肉性疾病相关。研究AQP4（一种水通道蛋白）与OAPs结构形成的关系，有助于揭示上述疾病的机制。请回答问题：

(1)AQP4有M1和M23两种分子量相近的亚型，二者均可独立构成四聚体发挥作用。科研人员发现导入并稳定表达M23基因的细胞，其细胞膜上有OAPs形成，而敲除该基因的细胞中未见OAPs的形成，该结果表明______。

(2)科研人员继续对M1与OAPs形成的关系进行了研究。

①提取大鼠脑组织的总RNA，通过______法获得cDNA，并通过______技术获得M1基因。

②将M1基因与质粒用______酶构建基因表达载体，导入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中，用______技术检测到受体细胞已成功表达M1蛋白。

③科研人员继续实验，方案及结果如下。

实验分组	1对照组	2对照组	3实验组
实验处理	a	b	导入M1基因的CHO细胞
	培养一段时间后裂解细胞并离心，取上清液中蛋白
检测指标	用电泳技术检测 c 的形成情况

请将表格中的实验方案补充完整。a：______，b：______，c：______。

(3)综合上述实验结果，AQP4与OAPs形成的关系为______。

Answer 1

【答案】M23可促进细胞膜上OAPs聚集 ①逆转录 PCR ②限制酶和DNA连接酶 抗原抗体杂交 导入M23基因的CHO细胞 导入空质粒的CHO细胞 OAPs M1与OAPs的形成无关，M23与OAPs的形成有关

【解析】

1、基因工程的操作过程

(1)目的基因的获取

①从基因文库中获取

基因文库包括：基因组文库和部分基因文库(其中的cDNA文库是利用反转录法获取的)。

②利用PCR技术扩增

a.变性(90～95℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链。

b.复性(55～60℃)：引物与DNA模板结合，形成局部双链。

c.延伸(70～75℃)：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的子链。

d.循环重复上述过程，n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍。

③利用化学方法人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知时，选择该方法。

(2)基因表达载体的构建

①通常用同一种限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将二者连接，改造后成为基因表达载体。

②组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点。

(3)将目的基因导入受体细胞

生物种类	植物	动物	微生物
常用方法	农杆菌转化法	显微注射技术	感受态细胞法
受体细胞	体细胞或受精卵	受精卵	原核细胞
转化过程	将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达	将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物	Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

(4)目的基因的检测与鉴定

①分子水平的检测

a．利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。

b．利用分子杂交技术检测目的基因的转录。

c．利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译。

②个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。

(1)题干提到“导入并稳定表达M23基因的细胞，其细胞膜上有OAPs形成，而敲除该基因的细胞中未见OAPs的形成”，该结果表明M23可促进细胞膜上OAPs聚集。

(2)由基因工程的操作过程可知：

①提取大鼠脑组织的总RNA，通过逆转录法获得cDNA，并通过PCR技术获得M1基因。

②将M1基因与质粒用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体，导入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中，用抗原—抗体技术检测到受体细胞已成功表达M1蛋白。

③由（1）可知M23可促进细胞膜上OAPs聚集，由此设计实验方案：

实验分组	1对照组	2对照组	3实验组
实验处理	导入M23基因的CHO细胞	导入空质粒的CHO细胞	导入M1基因的CHO细胞
	培养一段时间后裂解细胞并离心，取上清液中蛋白
检测指标	用电泳技术检测OAPs的形成情况

实验电泳图表明M1不能促进细胞膜上OAPs聚集。

(3)由于AQP4有M1和M23两种分子量相近的亚型，二者均可独立构成四聚体发挥作用，经实验表明M23可促进细胞膜上OAPs聚集，M1不能促进细胞膜上OAPs聚集，因此可得，M1与OAPs的形成无关，M23与OAPs的形成有关。