Question

12．凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶．直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向．用紫外线照射芽孢杆菌，分离、培养，并检测各菌株所产生的凝乳酶活力．操作过程如图1所示．请分析回答：

（1）图1所示的b过程的目的是为获得单个菌落，接种用的平板培养基不是（是/不是）选择培养基．
（2）在一定温度下（35℃），一定时间内（通常为40分钟），凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量为一个酶活力单位（U）．凝乳酶活力检测结果如图2所示．
①据图2所示，酶催化能力最强的是A₆组．
②A₂、A₅组酶活力与A₀组芽孢杆菌相同，两位同学对此做出了推测：
同学甲：A₂、A₅组芽孢杆菌未发生基因突变，而其他组发生的变化说明基因突变
具有不定向的特点．
同学乙：A₂、A₅组芽孢杆菌发生基因突变，但凝乳酶蛋白未改变，其依据的理由是一种氨基酸可能对应多种密码子（基因突变发生在非编码区）．为了验证上述2位同学的假设，可采用DNA分子杂交（DNA测序）技术检测凝乳酶基因是否发生了突变．
（3）从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中．
①从牛胃细胞中提取mRNA，再逆转录形成cDNA．以此cDNA为模板PCR扩增目的基因．
②构建重组DNA分子（如图3所示）最好选用BamHI和PstI限制酶．
③研究发现，如果将该凝乳酶20位和24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍．通过蛋白质工程生产高效凝乳酶，所需步骤有b、a、d、e（选择对即可得分，不要求排序）．
a．蛋白质的结构设计                  b．蛋白质的结构和功能分析
c．蛋白质结构的定向改造               d．凝乳酶基因的定向改造
e．将改造后的凝乳酶基因导入受体细胞     f．将定向改造的凝乳酶导入受体细胞．

Answer 1

分析 据图分析：图1所示的b过程为菌落的稀释，培养基中含有多种酶活力不同的突变芽孢杆菌．图2中，凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量最少的是6组．由图3可知，质粒和外源DNA中共同含有且不会破坏目的基因的限制酶是BamHI和PstI．

解答 解：（1）图1所示的b过程为菌落的稀释，目的是为获得单个菌落；由图可知培养基中含有多种酶活力不同的突变芽孢杆菌，故接种用的平板培养基不是选择培养基．
（2）①据图2所示，凝固1mL10%脱脂奶粉的酶量最少的是A₆组，故酶催化能力最强的是A6组．②同学甲：A₂、A₅组芽孢杆菌未发生基因突变，而其他组发生的变化说明基因突变具有不定向性的特点．同学乙：如果A₂、A₅组芽孢杆菌发生基因突变，但凝乳酶蛋白未改变，这可能是因为一种氨基酸可能对应多种密码子，随基因发生突变，但不会改变翻译出来的氨基酸；也可能是因为发生基因突变的区段为非编码区．为了验证上述2位同学的假设，可采用DNA分子杂交技术检测凝乳酶基因是否发生了突变．
（3）①牛胃细胞中含有能翻译出凝乳酶的mRNA，可逆转录得到cDNA．构建重组DNA分子时，需用同种限制性内切酶处理目的基因和载体，故需要在引物的5，端设计限制酶识别序列，以便构建重组DNA分子．
②由图3可知，质粒和外源DNA中共同含有且不会破坏目的基因的限制酶是BamHI和PstI，因此构建重组DNA分子最好选用BamHI和PstI限制酶，这样可以防止自身的黏性末端连接，防止目的基因与载体反向连接．
③通过分析想要的蛋白质的功能，预测蛋白质应有的结构，然后根据蛋白质的结构逆向推测控制该蛋白质合成的基因的碱基组成及排列顺序．最后就是将改造后的目的基因导入受体细胞，从而转录翻译得出目的蛋白．
故答案为：
（1）单个菌落       不是
（2）①A₆
②不定向
一种氨基酸可能对应多种密码子（基因突变发生在非编码区）
DNA分子杂交（DNA测序）
（3）①mRNA
②BamHI和PstI
③b、a、d、e

点评 本题结合图示主要考查基因工程的原理及技术基因工程的应用蛋白质工程，意在强化相关知识的识记、理解与运用．