Question

【题目】鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是__________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和__________序列，以便于后续的剪切和连接，一个DNA分子三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有__________个。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是__________。

A. Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点

B. 目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C. 酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D. 酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有__________，步骤③中需先用__________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过__________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________。

Answer 1

【答案】鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 6 AC 复制原点 Ca2+ 逆转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录

【解析】

分析题图：过程①表示目的基因的获取，过程②表示基因表达载体的构建，过程③表示将基因表达载体导入农杆菌中，过程④表示目的基因的检测和鉴定。

（1）干扰素基因属于目的基因。步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列。分析题图可知，该过程用EcoRI和BamHI两种限制酶分别切割目的基因和质粒，所以科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接。PCR技术的原理是DNA双链复制的原理，据此并结合利用PCR技术扩增目的基因的过程可推知：一个DNA分子三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有6个。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有1个切割位点；酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同。

（2）基因表达载体中除含有启动子、终止子、标记基因和目的基因外，还应有复制原点，以便使导入的目的基因能够在宿主细胞中复制，所以步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点。步骤③中需先用Ca2+处理农杆菌，使其成为感受态细胞，以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再进行PCR扩增。若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录。