Question

18．内皮素（ET）是一种含21个氨基酸的多肽，具有强烈的血管收缩和促进平滑肌细胞增殖等作用，其功能异常与高血压、糖尿病、癌症等有着密切联系．ET主要通过与靶细胞膜上的ET受体结合而发挥生物学效应．ET_A是ET的主要受体，科研人员试图通过构建表达载体，实现ET_A基因在细胞中高效表达，为后期ET_A的体外研究以及拮抗剂的筛选、活性评价等奠定基础．其过程如图所示，图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为CCC^↓GGG，限制酶XhoⅠ的识别序列为C^↓TCGAG．请分析回答：

（1）完成过程①需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和ATP和引物等，过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是使RNA链和DNA链分开．
（2）过程③和⑤中，限制酶XhoⅠ切割DNA，使磷酸二酯键断开，形成的黏性末端是；用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是使目的基因定向连接到载体上，以防止目的基因自身环化．
（3）构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录，除图示结构外，完整的基因表达载体还应具有复制原点、终止子等结构（至少写出两个结构）．
（4）过程⑥中，要用CaCl₂预先处理大肠杆菌，使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞．
（5）利用SNAP基因与ET_A基因结合构成融合基因，目的是检测ET_A基因能否表达及表达量．

Answer 1

分析 根据题意和图示分析可知：①②③表示反转录法获得目的基因的过程，④表示构建基因表达载体，⑤表示限制酶切割质粒，⑥表示重组质粒导入受体细胞，⑦表示目的基因的检测．

解答 解：（1）过程①以mRNA合成目的基因，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和ATP和引物等，过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是使RNA链和DNA链分开．
（2）过程③和⑤利用限制酶XhoⅠ切割DNA获得目的基因的过程，限制酶使得DNA的磷酸二酯键断开，形成的黏性末端是．图中显示利用了两种限制酶切割目的基因和载体，从而获得了不同的黏性末端，可以使目的基因定向连接到载体上，以防止目的基因自身环化．
（3）目的基因上游的启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录，除图示结构外，完整的基因表达载体还应具有复制原点、终止子等结构．
（4）过程⑥中，要用CaCl₂预先处理大肠杆菌，使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞．
（5）利用SNAP基因与ET_A基因结合构成融合基因，目的是检测ET_A基因能否表达及表达量．
故答案为：
（1）逆转录酶和ATP　   使RNA链和DNA链分开
（2）磷酸二酯 使目的基因定向连接到载体上，以防止目的基因自身环化
（3）RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录       复制原点、终止子
（4）感受态
（5）检测ET_A基因能否表达及表达量

点评 本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识图能力和判断能力，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，能结合图中信息并运用所学知识综合分析问题和解决问题的能力．