Question

9．人抗凝血酶Ⅲ由人体肝细胞产生，具有抗凝血、防血栓的作用．研究人员通过培育山羊乳腺生物反应器大量生产人抗凝血酶Ⅲ．请回答下列问题：
（1）获取人抗凝血酶Ⅲ基因常用方法有两种，一种是从人的肝细胞（肝脏）中获取该基因mRNA，逆转录成cDNA．另一种是PCR，根据人抗凝血酶Ⅲ基因上游及下游的碱基序列，设计2种特异性引物，从染色体DNA上获取并扩增人抗凝血酶Ⅲ基因．在PCR过程中，两个引物是Taq酶（耐高温DNA聚合酶）的结合位点，也是子链延伸的起点，dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在此过程中的作用是提供合成DNA的原料和能量．
（2）重组人抗凝血酶Ⅲ基因表达载体由山羊β-酪蛋白基因启动子、人抗凝血酶Ⅲ基因、标记基因和终止子组成，其中山羊β-酪蛋白基因启动子决定了人抗凝血酶Ⅲ基因只能在山羊乳腺细胞中特异性表达．
（3）山羊的ES细胞来自早期胚胎干细胞．在饲养层细胞上培养时，ES细胞具有只分裂不分化的特性．将重组人抗凝血酶Ⅲ基因表达载体包埋在由磷脂双分子层构成的脂质体内并转染ES细胞时，该表达载体进入ES细胞的方式为胞吞．
（4）对山羊进行同期发情和超数排卵处理，得到代孕母羊和多个卵母细胞，当卵母细胞培养至MⅡ中期（减数分裂第二次分裂中期）时，可去核并移入上述ES细胞的细胞核，完成核移植．为选择雌性胚胎，可在囊胚时取滋养层细胞做DNA（基因）分析用以鉴定性别．对于羊奶中是否含有人抗凝血酶Ⅲ，可用抗原-抗体杂交方法检测．

Answer 1

分析 1、基因工程中获取目的基因的方法有三种：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法：包括反转录法和化学合成法．
2、启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质．
3、胚胎干细胞
（1）哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来．
（2）具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞．另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造．

解答 解：（1）通过反转录法获取目的基因时，由于抗凝血酶Ⅲ基因在肝细胞中选择性表达，因此需要从人的肝细胞中获取该基因mRNA，逆转录成cDNA．利用PCR技术扩增目的基因时，两个引物是Taq酶（耐高温DNA聚合酶）的结合位点，也是子链延伸的起点，dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在此过程中的作用是提供合成DNA的原料和能量．
（2）启动子能够启动基因的转录，重组人抗凝血酶Ⅲ基因表达载体中的山羊β-酪蛋白基因启动子决定了人抗凝血酶Ⅲ基因只能在山羊乳腺细胞中特异性表达．
（3）在饲养层细胞上培养时，ES细胞具有只分裂不分化的特性．将重组人抗凝血酶Ⅲ基因表达载体包埋在由磷脂双分子层构成的脂质体内并转染ES细胞时，脂质体类似于囊泡，因此该表达载体进入ES细胞的方式为胞吞．
（4）卵母细胞需要培养至MⅡ中期时才具备受精的能力，因此将培养至该时期的卵母细胞可去核并移入上述ES细胞的细胞核，完成核移植．为选择雌性胚胎，可在囊胚时取滋养层细胞做 DNA（基因）分析用以鉴定性别．故答案为：
（1）肝细胞（肝脏）    Taq酶（耐高温DNA聚合酶）    合成DNA的原料和能量
（2）山羊β-酪蛋白基因启动子
（3）只分裂不分化    胞吞
（4）MⅡ中期（减数分裂第二次分裂中期）  DNA（基因）

点评 本题结合山羊乳腺生物反应器，考查了基因工程、胚胎工程的有关知识，要求考生识记基因工程的原理、工具、操作过程及应用；识记胚胎干细胞的特点及应用，能运用所学的知识答题．