题目内容
【题目】图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因（抗冻基因）番茄的示意图，外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因，请回答下列问题。
（1）图甲中通常选用质粒C构建重组质粒，而不选用质粒A或质粒B,其中不用质粒A原因是____________________________________。
（2）据图乙分析，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶_____切割目的基因和质粒。
（3）从cDNA文库中获得的目的基因______（填“含有”或“不含有”）启动子和终止子。
（4）在构建基因表达载体过程中常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在目的基因上游。双启动子作用是________________________。
（5）图乙农杆菌中的质粒应含有______，其作用是携带目的基因进入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA。从分子水平检测AFPs基因是否成功表达的方法是_____________。若要获得抗冻能力更强的抗冻番茄，可以对AFPs基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到______工程。
（6）为使改造后的AFPs基因能够表达，人工设计质粒D并对它的多个酶切位点进行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位点为计算起点，则KpnⅠ酶切割位点与HindⅢ酶切割位点最短长度为_______，EcoRⅠ酶的两个切割位点与HindⅢ切割位点的最短距离为_________。
【答案】质粒A中没有标记基因，质粒B的复制原点中含有HindⅢ酶切位点 BamHⅠ和HindⅢ 不含有 保证目的基因的高效转录（高效表达） T-DNA 抗原-抗体杂交法 蛋白质 750bp 500bp
【解析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）根据甲图分析，质粒A没有标记基因，质粒B的复制原点中含有限制酶HindⅢ切割位点，可能会破坏复制原点，而质粒C含有多个标记基因和酶切位点，适宜作为基因工程的载体。
（2）图乙中，选用的是质粒C作为基因工程的载体，结合目的基因两端的酶切位点，目的基因和载体可以选择BamHⅠ和HindⅢ同时切割，或者选择EcoRⅠ和HindⅢ同时切割，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶BamHⅠ ( 会破坏Tc为四环素抗性基因)和HindⅢ切割，可以根据是否对四环素有抗性来筛选。
（3）从cDNA文库中获取的目的基因不含有启动子、终止子、内含子等。
（4）双启动子作用是保证目的基因的高效表达。
（5）农杆菌转化法中的Ti质粒含有的T-DNA可以携带目的基因进入番茄细胞并整台到番茄细胞的染色体DNA上；从分子水平检测AFPs基因是否成功表达的方法是抗原-抗体杂交法；对AFPs基因进行改造，进而达到改造获得抗冻能力更强的抗冻番茄，需要通过蛋白质工程实现。
（6）根据题意分析，若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，说明该质粒上只含有HindⅢ酶的一个酶切位点和KpnⅠ酶的一个酶切位点；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500b和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段，说明EcoRⅠ酶有2个酶切位点，且两个位点之间的最短距离是500bp ，而KpnⅠ酶的切点在2个EcoRⅠ酶切点之间，距离每个EcoRⅠ酶切点250bp，HindⅢ酶切点距离最近的EcoRⅠ酶切点的最短距离是500bp，距离另一个EcoRⅠ酶切点的距离是500+ 500= 1000bp， 故KpnⅠ酶切割位点与HindⅢ酶切割位点最短长度为250+500= 750bp，EcoRⅠ酶的两个切割位点与HindⅢ切割位点的最短距离为500bp。
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