Question

14．透明质酸酶临床常用作药物渗透剂，目前市场上出售的透明质酸酶主要从动物组织中提取，成本高且提纯困难．科研人员尝试将透明质酸酶基因（Hyl）高效表达；重叠延伸PCR是一种定点突变技术，主要设计思路是用具有互补配对片段的引物，进行PCR1和PCR2获得部分重叠的两种 DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠部分的互补和延伸获得目的基因．其过程如图所示，Nco I和XhoI为限制酶识别位点．请分析回答下列有关问题：

（1）步骤②中所用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，NcoⅠ切割磷酸二酯键．
（2）步骤①进行定点突变的目的是防止限制酶（NcoI）破坏目的基因，将透明质酸酶基因转入大肠杆菌使其高效表达，利用了大肠杆菌的繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少特点，导入大肠杆菌时，首先要用Ca²⁺处理．
（3）在利用重叠延伸PCR进行定点突变时需要如图所示四种引物，若PCR1所用引物为引物1和引物3，则PCR2时B 点所选用的引物是图中的引物4，如果突变后的透明质酸酶基因进行PCR，所选的引物为引物1和引物2．
（4）谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶是长期用于病毒性肝炎患者肝功能的检测指标．最近，研究者提出检测空腹血清透明质酸酶水平了解肝硬化患者的肝损害程度，请分析其机理．正常情况下，透明质酸酶在细胞中存在，血清透明质酸酶高，说明肝细胞坏死增多．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）步骤②表示基因表达载体得到构建，该过程中首先需要利用同种限制酶切割目的基因和质粒，再利用DNA连接酶构建重组质粒，限制酶切割的是磷酸二酯键．
（2）分析图解可知，图中目的基因的中间存在NcoⅠ限制酶的切割位点，因此步骤①进行定点突变是为了防止限制酶（NcoI）破坏目的基因；由于大肠杆菌具有繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少特点，因此常作为基因工程的受体细胞，并且目的基因导入大肠杆菌时，首先要用Ca²⁺处理，使其成为感受态细胞．
（3）在利用重叠延伸PCR进行定点突变时需要如图所示四种引物，若PCR1所用引物为引物1和引物3，则PCR2时B点所选用的引物是图中的引物4，如果突变后的透明质酸酶基因进行PCR，所选的引物为引物1和引物2．
（4）正常情况下，透明质酸酶在细胞中存在，血清透明质酸酶高，说明肝细胞坏死增多，因此可以通过检测空腹血清透明质酸酶水平了解肝硬化患者的肝损害程度．
故答案为：
（1）限制酶和DNA 连接酶      磷酸二酯键
（2）防止限制酶（Nco I ）破坏目的基因   繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少   Ca²⁺
（3）引物4   引物1 和引物2
（4）正常情况下，透明质酸酶在细胞中存在，血清透明质酸酶高，说明肝细胞坏死增多

点评 本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够掌握基因工程的工具以及工具酶的作用部位，掌握基因工程的原理和操作步骤，掌握PCR技术定点诱变的原理，再结合所学知识准确答题．