题目内容
【题目】科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstI、SmaI、HindIII、AIuI等四种限制性核酸内切酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampt为抗氨苄青霉素基因），其中①∽④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，I、II表示相关结构或细胞。请据图作答：
（1）在构建重组DNA时，可用一种或多种限制性核酸内切酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性核酸内切酶______________分别对鱼抗冻蛋白基因和质粒进行切割，切割后产生的DNA片段分别为__________、_________种。
（2）基因工程中核心步骤是_________（填序号）,该步骤的目的是_________________________。为了使目的基因正常表达，其首端必须有启动子，它是___________识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端，要选择___________进行连接。（填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）
（3）图中将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法称为____________________。它是利用运载体Ti质粒中含有___________，可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上。
（4）检测番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因是否成功表达，从分子水平常采用的方法是________。
【答案】 PstI、SmaI 4 2 ① 使目的基因稳定存在并能遗传下去，使目的基因表达及能发挥作用 RNA聚合酶 T4DNA连接酶 农杆菌转化法 TDNA 抗原—抗体杂交
【解析】试题分析：据图分析，鱼的抗冻蛋白基因（目的基因）上具有三种限制酶切割位点，PstⅠ酶的切割位点存在于目的基因的两侧，SmaⅠ酶的切割位点存在于目的基因的左侧，而AluⅠ酶的切割位点存在于目的基因的中央，因此不宜选用AluⅠ酶；质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，因此应该选择PstI、SmaI分别切割目的基因和质粒；图中①～④分别表示：基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、脱分化、再分化。
（1）根据以上分析已知，在此实验中应该选用限制性核酸内切酶PstI、SmaI分别对鱼抗冻蛋白基因和质粒进行切割，切割后目的基因所在的DNA产生4个（种）DNA片段、质粒产生2个（种）DNA片段。
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图中的①步骤，目的是使目的基因稳定存在并能遗传下去，使目的基因表达及能发挥作用；基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点；T4DNA连接酶可以连接平末端。
（3）将目的基因导入番茄细胞等植物细胞常用农杆菌转化法，利用运载体Ti质粒中含有T-DNA，可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上。
（4）番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因表达的产物是抗冻蛋白，可以利用抗原—抗体杂交技术进行检测。
