（10分）mtDNA是存在于人类细胞线粒体中双链闭合环状的DNA分子，具有自我复制、转录和控制合成蛋白质的功能。mtDNA的类型具有明显的种族特异性。现用两种限制性核酸内切酶M和N切割某人的mtDNA（限制酶M和N的识别序列和切割位点如图1所示），然后通过凝胶电泳分离DNA片段（通电状态下，不同分子量的DNA片段在琼脂中的移动距离不同从而被分离），分析后得到下表。

（1）该mtDNA的长度为___________kb。在该DNA分子中，M酶与N酶的切割位点分别有____________个。

（2）M酶与N酶切出的能相互粘连的末端能在______________酶的作用下相互连接，请将连接的结果表示出来：_______________________。连接后的序列是否可以用M酶、N酶进行切割，请简述理由：________________________________________。

（3）图2为真核细胞的某基因的结构图以及限制酶M和N的切割位点。现用酶切法直接从供体细胞中切割图2中的基因从而获得目的基因，可选用酶______来切割。这个方法虽然操作方便，但切割下的基因中含有不能指导蛋白质合成的区域。因此，目前往往采用逆转录的人工合成的方法，其基本步骤是：__________________。

图2

（4）已知图2中Ⅱ区的碱基数是2000个，其中阴影区域碱基数是800个，空白区域中G 和C的总数共有400个，则由该区转录的mRNA中A和U总数是_____________。

假设A、b代表玉米的优良基因，这两种基因是自由组合的。现有AABB、aabb两个品种，为培育出优育品种AAbb，可采用的方法如图所示，有关叙述不正确的是

A．由品种AABB、aabb经过①、②、③过程培育出新品种的育种方式优点在于可以将多种优良性状集中在一个生物体上

B．与过程①②③的育种方法相比，过程⑤⑥的优势是明显缩短了育种年限

C．图中A　bb的类型经过过程③，子代中AAbb与aabb的数量比是3:1

D．过程④在完成目的基因和运载体的结合时，必须用到的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体

7．将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

表1   引物对序列表

表2  几种限制酶识别序列及切割位点数

请根据以上图表回答下列问题。

（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是__________。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？________________________________________。

（3）图1步骤3所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？                            

（4）PCR反应中由碱基错配引起的变异来源于__________。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段与原DNA相应片段相同的是__________。

（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。

①采用EcoRI和PstI酶切，得到__________种DNA片段。

②采用EcoRI和SmaI酶切，得到__________种DNA片段。

I 已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下：

（1）实验步骤①所代表的反应过程是             。

（2）步骤②构建重组表达运载体A和重组表达运载体B必须使用限制性内切酶和

          酶，后者的作用是将用限制性内切酶切割的            和          连接起来。

（3）如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能              ，也不能            。

（4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用

                与                  进行抗原―抗体特异性反应实验，从而得出结论。

II． 1958年，Meselson和Stahl通过一系列实验首次证明了DNA的半保留复制，此后科学家便开始了有关DNA复制起点数目、方向等方面的研究。试回答下列问题：

（1）由于DNA分子呈___________结构，DNA复制开始时首先必需解旋从而在复制起点位置形成复制叉（如图1）。因此，研究中可以根据复制叉的数量推测___________________。

（2）1963年Cairns将不含放射性的大肠杆菌（拟核DNA呈环状）放在含有³H-胸腺嘧啶的培养基中培养，进一步证明了DNA的半保留复制。根据右边的大肠杆菌亲代环状DNA示意图，在答题纸的相应方框内用简图表示复制一次和复制两次后形成的DNA分子。（注：以“……”表示含放射性的脱氧核苷酸链）。

（3）DNA的复制从一点开始以后是单向还是双向进行的，用不含放射性的大肠杆菌DNA放在含有³H-胸腺嘧啶的培养基中培养，给以适当的条件，让其进行复制，得到图3所示结果，这一结果说明________________。

（4）为了研究大肠杆菌DNA复制是单起点复制还是多起点复制，用第（2）题的方法，观察到的大肠杆菌DNA复制过程如图4所示，这一结果说明大肠杆菌细胞中DNA复制是            起点复制的。

右下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tct^R为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答下列问题：

⑴将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。
⑵用上述几种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________________；
⑶在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是                               。
⑷基因工程是一柄“双刃剑”，一方面可以极大地提高栽培作物的基因潜力，打破了种间的______隔离，从变异的角度看，基因工程的原理是_____________；另一方面也可能给生态系统和人类带来安全隐患，举一例简要说明：_______________________。