题目内容
【题目】嗜热菌可以生活在98℃的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA↓TATG、G↓AATTC、A↓AGCTT、G↓TCGAC。请分析回答：
（1）图中的结构A是_______，其主要作用是_____________________。一个完整的基因表达载体组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有_____________________。
（2）用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用________________两种限制酶进行切割，影响限制酶处理效果的因素可能有___________（多选）。
①反应温度 ②缓冲液pH ③限制酶的浓度 ④DNA样品的纯度
（3）实验中发现，重组质粒导入大肠杆菌后H基因的表达效率很低，但在含有质粒2（辅助性质粒）的细胞中，H基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加___________，整个实验过程应保持_________操作。
（4）PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是_________。
A．引物Ⅰ：…GGGAATTC…；引物Ⅱ：…CTCATATG…
B．引物Ⅰ：…GAATTCCC…；引物Ⅱ：…CATATGAG…
C．引物Ⅰ：…GGAAGCTT…；引物Ⅱ：…AAGCTTCC…
D．引物Ⅰ：…CTCATATG…；引物Ⅱ：…AAGCTTAAGCTT…
【答案】 启动子 提供RNA聚合酶特异性识别结合位点 目的基因、终止子（和复制原点） NdeⅠ、EcoRⅠ ①②③④ 抗生素A和抗生素B 无菌 AB
【解析】试题分析：本题结合基因结构图和运载体结构图，考查基因工程的技术和原理，重点是限制酶和DNA连接酶，要求学生认真分析题图，能根据图中信息选择合适的限制酶，准确判断使用DNA连接酶连接的结果，再运用所学的知识答题。解答本题的关键是熟记并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知识网络。
（1）据题图分析，由质粒1的结构、及质粒1和重组质粒上都具有A可推知，A是启动子，其作用是提供RNA聚合酶特异性识别结合位点，驱动基因转录。一个完整的基因表达载体组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因，而质粒1中已经含有启动子和标记基因（抗生素A抗性基因），故答案是目的基因、终止子。
（2）结合四种限制酶的识别序列和酶切位点，确定用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用NdeⅠ、EcoRⅠ两种限制酶进行切割，影响酶的因素都影响限制酶的处理效果，所以可能有温度、PH、酶浓度和底物的纯度，即①②③④。
（3）对两种质粒的标记基因进行分析后可知，质粒1上含有抗生素A的抗性基因，质粒2上含有抗生素B的抗性基因，所以应在筛选平板培养基中添加抗生素A和抗生素B。根据微生物的培养条件可知整个实验过程应保持无菌操作。
（4）分析切割质粒和目的基因的两种限制酶NdeⅠ、EcoRⅠ的识别序列和切割位点，发现AB选项的引物Ⅱ中有NdeⅠ的识别序列CA↓TATG，而AB选项的引物Ⅰ中都有EcoRⅠ的识别序列G↓AATTC，而CD中都不含，所以应选择AB。
