Question

【题目】抗凝血酶Ⅲ蛋白是一种血浆糖蛋白，临床上主要用于血液性疾病的治疗。凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。下列是生产这两种酶的相关思路，请回答下列问题：

（1）图1为通过培育转基因奶牛获得抗凝血酶Ⅲ蛋白的流程。

①图中过程a指的是利用___________法将抗凝血酶Ⅲ蛋白基因导入受精卵。受体细胞不选用体细胞的理由是______________________。

②b为早期胚胎培养和胚胎移植，在胚胎移植前，需进行___________，目的是确定要培育的个体能产牛奶。

③可采用抗原-抗体杂交法来鉴定转基因牛奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ蛋白。该方法需要使用抗凝血酶Ⅲ蛋白的单克隆抗体，请写出制备该抗体的实验思路___________。

（2）从牛胃液中分离得到的凝乳酶以其催化能力強而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。

①从牛胃细胞中提取mRNA，再通过___________形成cDNA。以此cDNA为模板通过PCR扩增目的基因，有肘需要在引物的5’端设计___________（填“限制酶”/“DNA连接酶”/“RNA聚合酶”）的识别序列，以便构建重组DNA分子。

②为提高重组DNA分子的比例，在构建重组DNA分子（如图2所示）时最好选用___________作限制酶。

③经研究发现，如果将该凝乳酶的第20位和24位氨基酸变为半胱氨酸，则其催化能力将提高2倍。现已知通过蛋白质工程可生产高效凝乳酶，应直接改造的是___________（凝乳酶蛋白/凝乳酶mRNA/凝乳酶基因）。

Answer 1

【答案】显微注射 动物体细胞的全能型一般不能表现出来 性别鉴定 向小鼠体内注射现成的（标准的/纯化后的）抗凝血酶Ⅲ蛋白；提取免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经多次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞；对杂交瘤细胞扩增培养获取大量的单克隆抗体。 逆转录 限制酶 BamHⅠ和PstⅠ 凝乳酶基因

【解析】

（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射法。此方法的受体细胞多是受精卵。（2）分析图1，a为将目的基因导入受体细胞的过程，b为早期胚胎培养和胚胎移植。在切割目的基因和质粒时，用双酶切可以防止自身环化和任意连接。

（1）①图中过程a指的是利用显微注射法将抗凝血酶III蛋白基因导入受精卵。由于动物体细胞的全能型一般不能表现出来，故受体细胞一般不选用体细胞。②需要将转基因受体细胞培育成转基因奶牛，只有母牛才能产奶，故在胚胎移植前，需进行性别鉴定，目的是确定要培育的个体能产奶。③制备抗凝血酶Ⅲ蛋白的单克隆抗体的过程是向小鼠体内注射现成的（标准的/纯化后的）抗凝血酶Ⅲ蛋白；提取免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经多次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞；对杂交瘤细胞扩增培养获取大量的单克隆抗体。

（2）①以提取的mRNA为模板，通过逆转录形成cDNA。而基因工程中需要用限制酶来切割DNA，因此在PCR扩增目的基因，有肘需要在引物的5’端设计限制酶的识别序列，以便构建重组DNA分子。②据图可知，用BamHI和PstI双酶切可有效避免质粒和目的基因自连，进而提高重组DNA的比例。③由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过基因来完成。故要通过蛋白质工程生产高效凝乳酶，应直接改造的是凝乳酶基因。