题目内容
【题目】黑胸大蠊是一种生活在我国南方地区的主要卫生害虫，通过生物防治手段可以起到一定抑制虫害的作用。某研究小组对黑胸大蠊浓核病毒的PfDNV基因与pUCl19质粒进行重组构建，通过感染黑胸大蠊研究其病理特征，已知KpnⅠ、PstⅠ、HindⅢ3种限制酶的酶切位点不同，Amp为氨苄青霉素抗性基因，实验过程图解如下。请分析回答下列问题：
（1）纯化后的PfDNV基因可通过___________技术扩增。常将PfDNV基因与pUC119 质粒采取加G—C尾的连接方式构建重组质粒，该加尾的连接方式能使重组质粒的热稳定性___________。
（2）研究小组将获得的重组质粒通过___________法转染大肠杆菌，在含有___________的培养基上培养一段时间后，挑选出部分菌株，用HindⅢ酶解菌株中的重组质粒，经电泳分析后发现有些菌株显示有5kb和3.7kb片段，还有些菌株显示有1.8kb和6.9kb片段，出现这种情况的原因是______________________。
（3）选择可以正常表达的重组质粒PfDNV-pUCl19，利用KpnⅠ酶酶解后回收7.3kb的片段，通过_______的作用获得PfΔKpn-pUC119重组质粒，将两种重组质粒通过腹部注射法注入黑胸大蠊幼虫体内，所得的结果如下表所示。
质粒转染黑胸大蠊实验结果
接种物 | 接种虫数 | 感染虫数 | 感染百分数（%） |
PfΔKpn-pUC119 | |||
（2500ng） | 20 | 20 | 100 |
（1250ng） | 20 | 1S | 90 |
（250ng） | 20 | 17 | 85 |
PfAKpn-pUC119 | |||
（2300ng） | 20 | 0 | 0 |
（1000ng） | 20 | 0 | 0 |
野生型病毒 | 20 | 20 | 100 |
未接种 | 20 | 0 | 0 |
从上表中可以看出，当注射的重组质粒PfDNV-pUCl19的量在___________ng及以上时，虫体最终死亡率与野生型病毒感染的结果—致。PfΔKpn-pUC119重组质粒注射幼虫后没有感染的根本原因是：KpnⅠ酶酶解后再连接，导致______________________。
【答案】 PCR 提高 感受态转化（冰冻的氣化钙溶液处理） 氨苄青霉素 基因和质粒的正向和反向连接 DNA连接酶 2500 PfDNV基因缺失了部分片段
【解析】试题分析：本题综合考查学生对基因工程的知识的识记和理解能力。解答本题需熟记并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知识网络。在此基础上，结合问题情境，从题图和题意中提取有效信息，进行相关问题的解答。
(1)纯化后的PfDNV基因可通过PCR技术扩增。常将PfDNV基因与pUC119 质粒采取加G—C尾的连接方式构建重组质粒，可使该“重组质粒”中的G—C碱基比例增加。DNA分子含有的氢键数越多，其结构越稳定，在每个DNA分子中，碱基对A与T之间有2个氢键，C与G之间有3个氢键，所以该加尾的连接方式能使重组质粒的热稳定性提高。
(2)研究小组将获得的重组质粒通过感受态转化（冰冻的氯化钙溶液处理）法转染大肠杆菌。重组质粒含有的Amp为氨苄青霉素抗性基因，使其对氨苄青霉素有抗性。在含有氨苄青霉素的培养基上培养一段时间后，可将成功导入目的基因的菌株挑选出来。HindⅢ酶解菌株中的重组质粒，经电泳分析后发现有些菌株显示有5kb和3.7kb片段，还有些菌株显示有1.8kb和6.9kb片段，结合图示分析可推知：出现这种情况的原因是基因和质粒的正向和反向连接。
(3)通过DNA连接酶可将KpnⅠ酶解后回收的7.3kb的片段连接，进而获得PfΔKpn-pUC119重组质粒。分析表中信息可知：当注射的重组质粒PfDNV-pUCl19的量在2500 ng及以上时，虫体最终死亡率与野生型病毒感染的结果—致。PfΔKpn-pUC119重组质粒注射幼虫后没有感染的根本原因是：KpnⅠ酶解后再连接，导致PfDNV基因缺失了部分片段。
