题目内容
【题目】hNaDC3（人钠/二羧酸协同转运蛋白-3）主要分布于肾脏等重要器官，它具有促进人肾小管上皮细胞能量代谢和转运等功能。科研人员利用基因工程技术构建绿色荧光蛋白与hNaDC3融合基因，并在肾小管上皮细胞中表达，以动态观察hNaDC3在肾小管上皮细胞中的定位情况，为进一步研究hNaDC3的生理功能奠定基础。研究主要过程如图（实验中使用的限制酶SacⅠ的识别序列是GAGCT↓C，限制酶SacⅡ识别序列是CCGC↓GG）。请分析回答：
（1）与PCR相比，过程①需要的特有的酶是_______，应从人体__________（器官）的组织细胞中获得模板RNA。
（2）DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是______。过程②选用SacⅠ、SacⅡ分别切割hNaDC3基因和质粒载体，可实现目的基因定向插入并正常表达的原因是_________。
（3）过程③可获得多种重组DNA，可依据不同DNA分子的大小，运用________（技术）分离、筛选重组表达载体。过程④将重组表达载体导入猪肾小管上皮细胞最常用的方法是____________。
（4）显微观察导入“绿色荧光蛋白-hNaDC3融合基因”的猪肾小管上皮细胞后发现：转染后第1天绿色荧光混合分布于细胞质和细胞膜，核中未见绿色荧光；到第5天绿色荧光清晰聚集于细胞膜，细胞质和细胞核中未见绿色荧光。根据这一观察结果还不能得出“hNaDC3是在细胞质中生成后，在细胞膜上发挥作用”的结论，需要设置对照实验以排除绿色荧光蛋白本身的定位，对照实验的设计思路是___________。
（5）研究人员以较高浓度的葡萄糖溶液培养导入融合基因的猪肾小管上皮细胞，一段时间后发现，转染细胞的细胞膜上绿色荧光明显增强。这一实验结果可以说明______。
【答案】逆转录酶 肾脏 —AGCT 两种限制酶切割产生的黏性末端不同 （凝胶）电泳 显微注射法 将GFP基因表达载体直接导入猪肾小管上皮细胞，然后观察绿色荧光在细胞中的分布情况 较高浓度葡萄糖能增强肾小管上皮细胞中hNaDC3基因的表达
【解析】
对题图进行分析可知，过程①以RNA为模板，通过反转录作用合成目的基因；过程②表示构建hNaDC3基因表达载体；过程③表示构建绿色荧光蛋白-hNaDC3融合基因的表达载体；④表示将目的基因导入受体细胞；⑤表示目的基因的检测和鉴定。
（1）过程①以RNA为模板，通过反转录作用合成目的基因。与PCR相比，过程①需要的特有的酶是逆转录酶。由于基因的选择性表达，所以只能从人体肾脏的组织细胞中获得模板RNA。
（2）根据题意可知，“限制酶SacⅠ的识别序列是GAGCT↓C”，因此DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是—AGCT。过程②选用SacⅠ、SacⅡ分别切割hNaDC3基因和质粒载体，两种限制酶切割产生的黏性末端不同，因此可实现目的基因定向插入并正常表达。
（3）过程③可获得多种重组DNA，可依据不同DNA分子的大小，运用（凝胶）电泳分离、筛选重组表达载体。将重组表达载体导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。
（4）根据题意可知，实验探究目的为“hNaDC3是在细胞质中生成后，在细胞膜上发挥作用”。需要设置对照实验排除绿色荧光蛋白本身的定位，即将GFP基因表达载体直接导入猪肾小管上皮细胞，然后观察绿色荧光在细胞中的分布情况。
（5）用较高浓度的葡萄糖溶液培养导入融合基因的猪肾小管上皮细胞，一段时间后发现，转染细胞的细胞膜上绿色荧光明显增强，说明较高浓度葡萄糖能增强肾小管上皮细胞中hNaDC3基因的表达。
