Question

【题目】图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体 质粒 P0 具有四环素 抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoR V 酶切位点为，EcoR V 酶切出来的线性载体 P1 为__________未端。

（2）用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺 嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________ 的 脱氧核苷酸，形成 P2；P2 和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质 粒 P3。

（3）为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表 中结果判断，应选择的菌落是_____（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、___________________。

菌落类型 平板类型	A	B	C
无抗生素	﹢	﹢	﹢
氨苄青霉素	﹢	﹢	﹣
四环素	﹢	﹣	﹣
氨苄青霉素+四环素	﹢	﹣	﹣

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙、丙 3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是____________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一 菌落的质粒中扩增出了 400 bp 片段，原因是_______________。

Answer 1

【答案】平 胸腺嘧啶(T) DNA连接 B A类菌落含有PO C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接

【解析】

基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。

（1）根据题意分析，EcoRV 酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。

（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3

（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0； C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。

（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR 鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙：根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。