题目内容
【题目】癌细胞表面蛋白“PDL﹣1”与T细胞表面蛋白“PD﹣1”特异性结合后，可抑制T细胞活性并启动其凋亡，导致肿瘤细胞发生免疫“逃逸”。研究者对“PD﹣1”基因进行克隆、表达及生物学活性鉴定，为制备抗体打基础。研究中所用引物α和β碱基序列见图1、几种常用限制酶名称及识别序列与酶切位点见图2：
（1）首先提取细胞中的mRNA反转录生成_____作为模板：设计含有不同的限制酶切点的α和β序列为引物，通过_____技术扩增目的基因。
（2）选用图1中的两种名称分别为_____的限制酶将“pIRES2﹣EGFP质粒”载体进行双切，再用DNA连接酶将其与目的基因拼接，构建表达载体。该表达载体的组成，除了目的基因、标记基因抗卡那霉素基因外，还必须具有_____等
（3）而后一定温度下，与经过Ca2+处理的感受态大肠杆菌混合培养在含有_____培养基中，可筛选出已经完成转化的大肠杆菌，继续培养该种大肠杆菌以扩增重组DNA。
（4）将扩增后的“pIRES2﹣EGFP载体/PD﹣1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后，为确定PD﹣1基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有_____。为判断其是否具有生物学活性和功能，则可裂解293T细胞，提取该物质看能否与_____发生结合，从而阻断“PD﹣1与PDL﹣1信号通路”。研究中还会有一步骤，只将“pIRES2﹣EGFP载体”转入293T细胞，其目的是_____。
【答案】cDNA PCR XhoI、EoRI 启动子、终止子、复制原点 卡那霉素 PD﹣1蛋白 PDL﹣1或答ⅣD﹣1抗体 作为对照
【解析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）以mRNA为模板反转录形成cDNA；扩增目的基因可采用PCR技术。
（2）根据图1中碱基序列和图2中四种限制酶的识别序列可知，选用图1中的两种名称分别为XhoI、EoRI的限制酶将“pIRES2EGFP质粒”载体进行双切，再用DNA连接酶将其与目的基因拼接，构建表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。
（3）根据第（2）题可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此培养基中需要加入卡那霉素。
（4）将扩增后的“pIRES2EGFP载体/PD1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后，为确定PD1基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有PD1蛋白。为判断其是否具有生物学活性和功能，则可裂解293T细胞，提取该物质看能否与PDL1发生结合，从而阻断“PD1与PDL1信号通路”。研究中还会有一步骤，只将“pIRES2EGFP载体”转入293T细胞，其目的是作为对照。
