题目内容
37．（8分）大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的运载体。某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出口一半乳糖苷酶。当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β一半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。
请分析并回答：
（1）已获得的目的基因可利用 技术进行扩增。
（2）目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复 键。
（3）将试管I中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是 ；大肠杆菌需事先用Ca2+进行处理，目的是 。
（4）将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质包括 和生长因子，还应加入IPTG、X-gal以及氨苄青霉素，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出 。
（5）若观察到培养基上出现 色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是 。
【答案】
37.（8分）
（1）PCR
(2) 磷酸二酯
（3）进行转化 使大肠杆菌细胞处于感受态
（4）碳源、氮源、无机盐、水 导入pUC18质粒的大肠杆菌
（5）白 无论大肠杆菌是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落
【解析】本题考查基因工程的知识。已获得的目的基因可利用PCR技术进行扩增；培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质包括碳源、氮源、无机盐、水和生长因子，还应加入IPTG、X-gal以及氨苄青霉素，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出导入pUC18质粒的大肠杆菌。
①如果长出蓝色菌落，说明重组的运载体pUC18质粒已转入受体菌，但目的基因没有接入运载体（或说明重组质粒没导入受体大肠杆菌）
②如果长出白色菌落，说明重组质粒已导入受体大肠杆菌
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研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。
（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经________获得内皮抑素基因，再经________进行扩增，以获得更多的目的基因。
（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有________和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成________颜色的菌落，原因是__________________。
（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
| 粗提表达产物浓度/(μg·mL－1) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 活的内皮细胞数目(×102) | 12 | 6 | 2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
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研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。
（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经________获得内皮抑素基因，再经________进行扩增，以获得更多的目的基因。
（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切避免了目的基因与载体________连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有________和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成________颜色的菌落，原因是__________________。
（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。
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粗提表达产物浓度/(μg·mL－1) |
0 |
2 |
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8 |
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活的内皮细胞数目(×102) |
12 |
6 |
2 |
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0.5 |
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实验结果说明_____________________________________________________
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