题目内容
【题目】某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5’末端，获得了Ll-GFP融合基因，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体Pl，其部分结构和酶切位点如下图所示，图中El～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：
(l)该团队在将Ll-GFP融合基因插入质粒P0时，使用了两种限制酶，据图推断它们是____。使用这两种酶进行酶切是为了保证____，也是为了保证____的正确连接。
(2)为获得含有LI-GFP融合基因的牛，可将能够产生绿色荧光细胞的细胞核植入牛的____中，再进行体外培养、胚胎移植等相关操作。若采用胚胎分割移植技术一次获得多头表型相同的转基因牛，在对处于囊胚阶段的胚胎进行分割时，应注意____。
(3)为检测Ll-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 ___作为PCR模板。利用PCR技术进行DNA扩增时，除模板外，还必须提供的物质是 __。
【答案】E1和E4 Ll-GFP融合基因的完整 Ll- GFP融合基因与载体 去核卵母细胞 内细胞团均等分割 核DNA 与模板链结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶
【解析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5ˊ末端而获得的L1-GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。
（2）若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛，若采用胚胎分割移植技术一次获得多头表型相同的转基因牛，在对处于囊胚阶段的胚胎进行分割时，应注意内细胞团均等分割。
（3）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板，用PCR技术进行DNA扩增时，除模板外，还必须提供的物质是与模板链结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶。
