Question

【题目】锌指核酸酶（ZFN）是由锌指蛋白（Zn）与核酸内切酶（FokI）组成的融合蛋白．每个FokI单体与3个锌指蛋白单元相连，构建一个ZFN．通过3个Zn的组合可构建识别不同序列的ZFN．当2个ZFN的识别位点相距恰当的距离时，2个ZFN就形成二聚体产生酶切功能．图1表示锌指核酸酶的作用过程，其中虚线段之间为6个碱基对．

（1）据图1分析，在锌指核酸酶中，识别特定核酸位点的结构是_____，切断相邻核苷酸之间化学键的结构是_____．

（2）据图1分析，一个ZFN单体能识别_____个碱基的特定序列，图1中的2个ZFN单体识别的碱基序列_____（相同/不相同）．

双链DNA分子中常存在4﹣8对碱基序列，呈旋转对称回文结构．不同的回文结构能被不同的限制酶识别并切割，如下表所示．回文序列也可通过构建相应的锌指核酸酶进行切割．图2为一段已知的碱基序列．

表：识别的回文序列及切割位点

限制酶	BamHⅠ	HindⅢ	EcoRⅠ	SmaⅠ
识别的回文序列及切割位点

（3）表中能够对图2序列进行切割的酶是__，并将该限制酶切割所产生的末端序列在下边方框中补充完整___．若要得到相同的末端，所构建的ZFN在①链上的识别序列是_____（从左到右书写）．

（4）理论上，通过不同锌指蛋白单元的组合，ZFN可以酶切DNA片段上任意的部位．那么理论上一个锌指蛋白单元有_____种，由其构成的ZFN有_____种．

Answer 1

【答案】锌指蛋白 FokI 9 不相同 EcoR I ACG﹣TGC﹣CGA 64 643

【解析】

分析图1：锌指核酸酶（ZFN）是由3个锌指蛋白（Zn）与1个核酸内切酶（FokI）组成的融合蛋白，每个锌指蛋白能识别3个碱基，因此一个ZFN单体能识别9个碱基的特定序列；图中左侧ZFN单体识别的序列为GCG-GGT-GGG，而右侧ZFN单体识别的序列为GCG-GGT-GCG，因此这2个ZFN单体识别的碱基序列不相同。

（1）由图1可知，在锌指核酸酶中，识别特定核酸位点的结构是锌指蛋白，切断相邻核苷酸之间磷酸二酯键的结构是核酸内切酶（FokI）。

（2）由图1可知，一个ZFN单体包括一个FokI单体与3个锌指蛋白，其中每个锌指蛋白能识别3个碱基，因此一个ZFN单体能识别9个碱基的特定序列；图1中的2个ZFN单体识别的碱基序列不相同（左侧ZFN单体识别的序列为GCG﹣GGT﹣GGG，而右侧ZFN单体识别的序列为GCG﹣GGT﹣GCG）。

（3）对照图2和表中四种限制酶的识别序列可知，表中能够对图2序列进行切割的酶只有EcoRI，由于EcoRI的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，且切割位点在G和A之间，因此用该酶切割后产生的末端序列为．若要得到相同的末端，所构建的ZFN在①链上的识别序列是限制酶EcoRI的识别序列的后9个碱基序列，即ACG﹣TGC﹣CGA。

（4）一个锌指蛋白单元对应3个碱基，每个ZFN有3个锌指蛋白单元，因此理论上一个锌指蛋白单元有4×4×4＝64种，由其构成的ZFN有64×64×64＝643种。