题目内容
【题目】凝乳酶是奶酪生产中的关键，从小牛胃液中分离得到的凝乳酶以其催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。请分析回答：
（1）从小牛体内提取的凝乳酶基因通常需要通过___________技术进行扩增，扩增时一般需要在引物的5′端设计一段___________酶的识别序列，以便构建重组DNA分子，并需要在反应体系中加入___________种引物。
（2）研究者利用4种限制酶切割目的基因和质粒，各限制酶的识别序列和切割位点如下图所示。酶切破坏了 DNA分子中的___________键，每一次切割会产生___________个游离的磷酸基团。酶切后的产物连接时，目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上___________切割产生的末端相连接。连接完成后，该连接点___________（能/不能）被这两种限制酶中的某一种切割。
（3）经研究发现，如果将该凝乳酶的第20位和24位氨基酸变为半胱氨酸，则其催化能力将提高2倍，可通过___________技术对该凝乳酶进行改造。
【答案】PCR 限制酶 2 磷酸二酯键 2 XhoⅠ 不能 蛋白质工程
【解析】
1.PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，原理是DNA双链复制的原理，该过程需要加入模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸以及热稳定性DNA聚合酶。
2.图中4种限制酶识别的序列各不相同，NstⅠ与PstⅠ切出的黏性末端相同，SalⅠ与XhoⅠ切出的黏性末端形同。
（1）对目的基因的扩增用PCR技术，扩增时一般需要在引物的5′端设计一段限制酶的识别序列，以便构建重组DNA分子，PCR扩增过程需要加入2种引物，以便进行复制延伸。
（2）限制酶是在核苷酸之间的磷酸二酯键之间切割，图中的限制酶每一次切割后会得到两个单核苷酸链的黏性末端，会有2个游离的磷酸基团。限制酶SalⅠ与限制酶XhoⅠ 切割后获得的黏性末端相同，因此目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上XhoⅠ切割产生的末端相连接。连接完成后，该连接点形成的序列无法被这两种酶识别，因此不能被这两种限制酶中的某一种切割。
（3）通过蛋白质工程可以改造凝乳酶，获得所需要的蛋白质。
