题目内容
【题目】随着基因工程、细胞工程等现代生物科技的发展，人们生活中一些难以治愈的疾病有了一些新的治疗手段，其中基因打靶是一项常用的技术手段。基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。结合下图回答下列问题：
注：neo＇是新霉素抗性基因；HSV-tK基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡。
（1）将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到质粒上，构建打靶载体（基因表达载体），该过程需要用到的工具酶有______________________。
（2）打靶载体测序验证正确后，利用_________酶，将之线性化，以提高重组率。然后通过_______技术将其导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有概率发生同源重组。
（3）为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入________进行初步筛选。最后还需要通过________技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因的细胞），将这样的细胞通过扩大化培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行_____________保存。
（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、__________的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行 ___________检查，确保其生下嵌合小鼠。
【答案】 限制性内切酶和DNA连接酶 限制 显微注射 新霉素和丙氧鸟苷 DNA分子杂交 液氮（或冷冻） 生理状态相同（或经同期发情） 是否妊娠
【解析】本题考查基因工程和胚胎工程的操作步骤和流程，意在考察考生对中知识点的理解和应用能力。
（1）构建基因表达载体，需要用同种限制性内切酶对目的基因和运载体进行切割，然后用DNA连接酶将目的基因和运载体相连接。
（2）打靶载体测序验证正确后，原来是环状的，可以利用限制酶将其切开线性化。目的基因要导入动物细胞中需用显微注射法。
（3）由图可知重组后的DNA中含有新霉素抗性基因和但无HSV-tK基因，所以可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷，如果细胞能存活下来，初步证明重组成功。需要进一步筛选需要用DNA分子杂交技术，可以确定看是否存在靶基因。对于暂时不用的细胞可以在液氮中进行冷冻保存。
（4）胚胎移植时，需要移植到同种、生理状态相同的母鼠体内，可以用性激素进行同期发情处理得到。一段时间后对受体母鼠进行是否妊娠检查，确保能生下嵌合小鼠。
