Question

【题目】下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用____________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过______________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入经____________处理过的_____________态的大肠杆菌中。

(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________________________。平板上长出的菌落，常用 PCR 鉴定，所用的引物组成为图2中的_____________。

(3)若BamH I 酶切的 DNA 末端与 Bcl I 酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为______________________，对于该部位，这两种酶__________（填“都能”、 “都不能”或“只有一种能”）切开。

(4)若用 Sau3A I 切图 1 质粒最多可能获得________________种大小不同的 DNA 片段。

(5)图1中启动子的作用是__________________________________________________________。

(6)将目的基因导入棉花细胞，培育抗虫棉的过程涉及到哪些技术：_______________________________

Answer 1

【答案】Bcl I和Hand IIIDNA连接Ca+感受四环素引物甲和引物丙都不能7为RNA聚合酶提供识别和结合的部位，驱动转录基因工程技术(转基因技术)和植物组织培养技术

【解析】

分析图1：外源DNA上含有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII和Sau3AI的切割位点，其中限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII的识别序列都能被Sau3kI识别。分析图2：质粒上有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII三种限制酶的识别序列和切割位点，其中BamHⅠ的切割位点位于两种抗生素抗性基因上，而抗性基因为载体的标记基因，因此不可用该酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamHI、HindⅢ和Sau3AⅠ四种酶也存在酶切位点。

（1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，且会破坏质粒中的两个抗性基因；Sau3AI在质粒上有三个酶切位点，也会破坏质粒中的两个抗性基因，不利于后期的筛选，所以应选用限制酶为BclⅠ和Hind Ⅲ。选择的限制酶应在目的基因两侧切割，切割后的DNA片段用DNA连接酶连接。为了扩增重组质粒，需将其转入经钙离子处理过的感受态的大肠杆菌中。

（2）由上一问的讨论可知，重组质粒的氨苄青霉素抗性基因已经破坏，仅保留了四环素抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。

（4）根据BclI、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。

（5）启动子的作用是为RNA聚合酶提供识别和结合的部位，驱动转录。

（6）将目的基因导入棉花细胞，需要基因工程技术(转基因技术)；将得到的转基因细胞培育成抗虫棉植株的过程涉及到植物组织培养技术。