Question

目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

（1）建构基因表达载体时，必须有               、复制原点、目的基因、终止子以及                                    。

（2）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于                    。

（3）pBR322分子中有单个EcoRI限制酶作用位点，EcoRl只能识别序列—GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRl的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端                   。

（4）pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复         ，成功获得了重组质粒。说明                         。

（5）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落；再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是            。图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是                 。

Answer 1

（1）启动子  植物体细胞杂交  标记基因（可互换位置）

（2）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）。

（3）

（4）磷酸二酯    两种限制酶（BamHI和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同

（5）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素        pBR322质粒

【解析】作为运载体的质粒，应该具有标记基因，以利于鉴别目的基因是否导入受体细胞，还应该具有启动子和终止子，以利于目的基因的表达。限制酶的作用是切出黏性末端，连接酶的作用是催化3，5一磷酸二酯键的形成。既然经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用能恢复3，5一磷酸二酯键，则说明BarnHI和BglⅡ切割得到的黏性末端相同。实验由图二进行到图三，相当于应用了“孢子印”。如果图三的培养基与图二中的一样，则图三中的结果理应与图二一样。出现图三中的空圈，说明了图三中的四环素对大肠杆菌产生了毒害作用，也就说明了该种大肠杆菌无抗四环素的能力。