题目内容
【题目】蜘蛛丝是自然界中机械性能最好的天然蛋白纤维，其强度高于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。但如何大量获取蜘蛛丝纤维的问题一直难以解决。2018年8月，中科院分子植物科学卓越创新中心利用基因工程技术成功的在家蚕丝腺和蚕茧中大量表达蜘蛛丝蛋白。回答下列问题：
（1）构建基因表达载体时（如图所示），需要在目的基因前后两端分别引入______________的酶切位点，该方法比用同一种酶进行酶切的优势是___________________________（答出一点即可）。
（2）利用PCR技术扩增蜘蛛丝基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计____种引物，进行PCR时需加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，此操作的目的是__________________。
（3）为能从蚕丝中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的首段必须含有使其仅能在蚕的丝腺细胞中特异性表达的_______。当其与______识别和结合，才能驱动转录过程，最终翻译成功。
（4）在研究过程中，发现目的基因已经插入到蚕丝腺细胞染色体的DNA上，蚕丝中却未能提取到蜘蛛丝，请分析原因及检测方法_________________。
（5）研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50%，此成果所用到的工程技术为_____________________________________________。
【答案】Xba I和Sac I 防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接 2 使DNA解链，然后使引物结合到互补DNA链上 启动子 RNA聚合酶 蛛丝蛋白基因未能正常进行转录可用分子杂交技术检测，蛛丝蛋白未能进行正常翻译可用抗原抗体杂交技术检测 蛋白质工程
【解析】
在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，一般选用两种限制酶分别对目的基因、运载体进行切割。一个基因表达载体的组成，主要有目的基因、标记基因、启动子和终止子，其中启动子位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。据此根据题图，HindⅢ在标记基因中，故不能使用，只能选择Xba I和Sac I两种酶进行切割。PCR技术扩增DNA时，需要的条件有：目的基因、一对引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶等，反应过程是变性（当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链）→复性（温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）→延伸（72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸）。检测目的基因是否转录出了mRNA可用分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质可用抗原-抗体杂交技术。
（1）据分析可知，构建基因表达载体时需要在目的基因前后两端分别引入Xba I和Sac I 的酶切位点，相比用同一种酶进行酶切，用两种酶切割可以防止目的基因自身环化或防止目的基因反向连接。
（2）利用PCR技术扩增蜘蛛丝基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计2种引物；进行PCR时需加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，此操作的目的是使DNA解链，然后使引物结合到互补DNA链上。
（3）为能从蚕丝中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的首段必须含有使其仅能在蚕的丝腺细胞中特异性表达的启动子。当其与RNA聚合酶识别和结合，才能驱动转录过程，最终翻译成功。
（4）在研究过程中，发现目的基因已经插入到蚕丝腺细胞染色体的DNA上，蚕丝中却未能提取到蜘蛛丝，推测有两种可能，①是目的基因导入但没有正常转录，若蛛丝蛋白基因未能正常进行转录可用分子杂交技术检测；②是目的基因转录后没有翻译产生蛋白质，若蛛丝蛋白未能进行正常翻译可用抗原-抗体杂交技术检测。
（5）研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50%，此成果所用到的工程技术为蛋白质工程。
