Question

【题目】鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了________和________序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有________个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列_______(相同/不相同)

(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有________，步骤③中需先用________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是________________。

Answer 1

【答案】 鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 1 不相同 复制原点 Ca2+ 逆转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录 或鸡干扰素的mRNA 已经被水解

【解析】试题分析：本题考查基因工程，考查对目的基因获取、基因表达载体构建等基因工程步骤的理解，解答此题，可根据图中切割目的基因和质粒时所用的限制酶判断目的基因两端应添加的碱基序列，根据基因表达的环节分析愈伤组织细胞中不能检测出干扰素基因的原因。

(1)利用PCR技术扩增鸡干扰素基因时，引物应可以和鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列进行碱基互补配对，根据鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列可设计引物的碱基序列。据图可知，该转基因过程用EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶分别切割目的基因和质粒，以避免质粒或目的基因的自身连接，应在两种引物的一端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列GAATTC和GGATCC，以便于后续的剪切和连接。Ti质粒中每种限制酶有1个切割位点，则酶切产物两端粘性末端不同，不会发生自身环化。

(2)基因表达载体中除含有启动子、终止子、标记基因和目的基因外，还应含有复制原点，以便在宿主细胞中复制。将基因表达载体导入农杆菌，可用Ca2+处理农杆菌，以增大细胞壁通透性，提高转化效率。

(3提取愈伤组织细胞的RNA后，可通过逆转录获得DNA。鸡干扰素基因即便导入了农杆菌，也不一定能导入烟草愈伤组织细胞，导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因不一定能够正常转录，转录出的鸡干扰素的mRNA 若被水解，则不能通过逆转录获得鸡干扰素基因，以上原因均可能导致愈伤组织细胞中不能检测出鸡干扰素基因。