Question

【题目】图甲为构建重组质粒过程中的三种备选质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。图乙为培育转AFPs基因(抗冻基因)番茄的示意图，外源DNA和质粒上均标出了酶切位点及相关抗性基因，请回答下列问题。

(1)图甲中通常选用质粒C构建重组质粒，而不选用质粒A或质粒B的原因分别是______________________。

(2)据图乙分析，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶________切割目的基因和质粒。

(3)通过PCR技术获取目的基因时需设计________种引物；从cDNA文库中获得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)启动子和终止子。

(4)在构建基因表达载体过程中常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在目的基因上游。双启动子的作用可能是________。

(5)图乙农杆菌中的质粒应含有T－DNA，其作用是________。若要获得抗冻能力更强的抗冻番茄，可以对AFPs基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到____________工程。

(6)为使改造后的AFPs基因能够表达，人工设计质粒D并对它的多个酶切位点进行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位点为计算起点，则KpnⅠ酶切割位点与HindⅢ酶切割位点最短长度为________，EcoRⅠ酶的两个切割位点与HindⅢ切割位点的最短距离为________。

Answer 1

【答案】质粒A中没有标记基因，质粒B的复制原点中含有HindⅢ酶切位点 BamHⅠ和HindⅢ 2 不含有 保证目的基因的高效转录(高效表达) 携带目的基因进入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA 蛋白质 750bp 500bp

【解析】

基因工程的操作步骤：目的基因的获取、构建基因表达载体、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。

（1）质粒A缺乏标记基因，质粒B的复制原点中含有限制酶切割位点，可能会破坏复制原点，质粒C含有多个标记基因和酶切位点，适宜作为基因工程的载体。

（2）图乙中，选用的质粒C作为基因工程的载体，结合目的基因两端的酶切位点，目的基因和载体可以选择BamHⅠ和HindⅢ同时切割，或者EcoRⅠ和HindⅢ同时切割，若需使用插入灭活法筛选并鉴定重组质粒，应优先选用限制酶BamHⅠ（会破坏Tc）和HindⅢ切割，可以根据是否对四环素有抗性来筛选。

（3）启动子是RNA聚合酶结合的位点，是起始转录的位点，双启动子可能是为了高效转录。

（4）农杆菌转化法中的Ti质粒含有的T-DNA可以携带目的基因进入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体DNA上。对AFPs基因进行改造，进而达到改造获得抗冻能力更强的抗冻番茄，需要通过蛋白质工程实现。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶单独切割质粒D，均获得一条长链，说明该质粒上只含有HindⅢ酶的一个酶切位点和KpnⅠ酶的一个酶切位点；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个500bp和1个2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同时切割，则获得2个250bp和1个3166bp片段。说明EcoRⅠ酶有2个酶切位点，且两个位点之间的最短距离是500bp，而KpnⅠ酶的切点在2个EcoRⅠ酶切点之间，距离每个EcoRⅠ酶切点250bp，HindⅢ酶切点距离最近的EcoRⅠ酶切点的最短距离是500bp，距离另一个EcoRⅠ酶切点的距离是500+500=1000 bp。故KpnⅠ酶切割位点与HindⅢ酶切割位点最短长度为250+500=750 bp，EcoRⅠ酶的两个切割位点与HindⅢ切割位点的最短距离为500bp。