Question

【题目】GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。

（1）一个GDNF基因含有___个游离的磷酸基团，理论上而言，与GDNF基因含有相同碱基数的DNA分子共有_____种不同的排序。

（2）限制酶的特点是___________________________，构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的______限制酶进行酶切。

（3）下列有关基因工程的运载体中标记基因的说法正确的是_______。

A．可检测重组DNA分子是否导入了受体细胞

B．可指示受体细胞是否导入运载体

C．可指示运载体中是否插入了外源DNA片段

D．可检测目的基因在受体细胞中是否成功表达

（4）通常使用限制酶后会产生粘性末端，对下图所示粘性末端的说法正确的是______。

A．甲、乙、丙粘性末端是由各自不同的限制性核酸内切酶催化产生的

B．甲、乙具相同的粘性末端可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能

C．DNA连接酶作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键

D．切割甲的限制性核酸内切酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子

（5）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第_____泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。

Answer 1

【答案】2个 4700 特异性的识别并切割DNA XhoⅠ ABC ABD 2

【解析】

1、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）该基因是链状DNA分子，所以含有游离的磷酸基团2个，GDNF基因有700个碱基，所以可能的DNA分子由4700种。

（2）限制酶是能够特异性的识别DNA片段，并在特定的位点将DNA片段切割；由于质粒上有XhoⅠ识别位点，而且在启动子之后，所以选用XhoⅠ限制酶进行酶切。

（3）ABC、运载体中的标记基因可检测重组DNA分子是否导入了受体细胞或可指示哪些细胞是转化细胞或可指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段，ABC正确。

D、检测目的基因是否转录采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译采用抗原-抗体杂交法，D错误。

故选ABC。

（4）A、切割甲的限制酶的识别序列是-GAATTC-，切割乙的限制酶的识别序列是-CAATTG-，切割丙的限制酶的识别序列是-CTTAAG-，序列不同，所以是由不同的限制性核酸内切酶催化产生的，A正确；

B、甲和乙的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接形成重组DNA分子，而甲和丙的黏性末端不同，因此不能连接形成重组DNA分子，B正确；

C、DNA连接酶连接的是DNA片段，所以该酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，作用位点在a处，C错误；

D、甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列是-CAATTC-，而甲酶的识别序列是-GAATTC-，且在G和A之间切割，由此可见，甲酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。

故选ABD。

（5）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示），为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若属于载体自连，且产生的酶切片段只有一种；若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为2个，且长度分别与质粒和GDNF基因长度相同；若是正向连接的重组载体，酶切后产生两种长度的片段，即700bp和600bp，第二条带。